Kanülenimplantation in die Cisterna Magna im Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Xavier, A. L. R., et al. Kanülenimplantation in die Cisterna Magna von Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Implantation einer Kanüle in die Cisterna magna einer anästhesierten Maus. Bei der Technik wird eine auf der Nadel befestigte Kanüle durch die Dura in die umgekehrte dreieckige Cisterna magna geführt und für die gezielte Abgabe in das Liquor cerebrospinalis gesichert.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Chirurgischer Eingriff
   HINWEIS: Die chronische Cisterna magna (CM)-Kanüle ermöglicht es den Tieren, sich von dem chirurgischen Eingriff zu erholen. CM-Injektionen werden am Tag nach der Kanülenimplantation durchgeführt und können vor allem entweder bei anästhesierten oder wachen Tieren durchgeführt werden. Da es sich um eine Genesungsoperation handelt, sollten die Eingriffe unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
   1. Wiegen Sie die Maus (C57BL/6JRj, beide Geschlechter, 8 Wochen) und betäuben Sie sie mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (100 mg/kg; jeweils 10 mg/kg) durch intraperitoneale (i.p.) Injektion. Falls erforderlich, ist die Maus während des chirurgischen Eingriffs mit einer halben Dosis Ketamin (50 mg/kg) erneut zu dosieren. Alternativ können Sie die Maus für eine chronische Kanülierung anästhesieren, indem Sie sie in eine Isofluran-Induktionskammer mit 2,5 - 3 % Isofluran und ca. 1 l/min Sauerstoff (O₂) legen. Verwenden Sie in diesem Fall einen Nasenkonus, um die Isofluran-Anästhesie bei 1,5 - 2% während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten.
   2. Wenn die Zehenkneifreflexe aufhören und die Atmung langsam und gleichmäßig wird, setzen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen über einem Heizkissen.
   3. Tragen Sie eine Augensalbe auf. Wiederholen Sie dies während der Operation, wann immer dies erforderlich ist.
   4. Rasieren Sie den Kopf und den Hals der Maus, entfernen Sie das Fell und sterilisieren Sie die exponierte Haut zuerst mit einem Alkoholtupfer und dann zweimal mit Chlorhexidin (0,5 %) oder Jodlösung (2 %). Wiederholen Sie die Sterilisation noch zweimal.
      HINWEIS: Wechseln Sie das OP-Tuch, um nach der Rasur Ablagerungen und Haare zu entfernen. Drapieren Sie dann das Tier, um das sterile Feld zu schützen.
   5. Bei chronischer Kanülierung 0,5 - 1 ml Lidocain/Bupivacain (1 mg/ml bzw. 0,25 mg/ml) subkutan (s.c.) an der Inzisionsstelle verabreichen. Verabreichen Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg; s.c.) zur postoperativen Analgesie.
   6. Fixieren Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen. Nach der Fixierung, entweder intraaural oder durch den Jochbogen, neigen Sie den Kopf leicht, so dass er einen Winkel von 120° zum Körper bildet (Abbildung 1E).
   7. Finden Sie den Teil des Schädels, der unmittelbar über die Nackenmuskulatur hinausragt - den Hinterhauptkamm. Heben Sie die darüber liegende Haut mit einer Pinzette an und schneiden Sie ein mandelförmiges Stück Haut von ca. 1 cm entlang der Mittellinie ein. Verwende Wattestäbchen oder Augenspieße, um die daraus resultierenden Blutungen zu kontrollieren.
   8. Ziehen Sie mit dem Hinterhauptkamm als Referenzpunkt das oberflächliche Bindegewebe auseinander, um die darunter liegende Nackenmuskulatur freizulegen.
   9. Trennen Sie die Muskeln an der Mittellinie, indem Sie die Pinzette vorsichtig in der Mitte der Inzisionsstelle in der vorderen zur hinteren Achse entlangführen. Verbinden Sie mit einer gebogenen Pinzette in jeder Hand die Spitzen in der Mitte nahe der Unterseite des Schädels und ziehen Sie die Muskeln zur Seite.
      HINWEIS: Dies sollte das CM freilegen, das als winziges umgekehrtes Dreieck erscheint, das oben vom Kleinhirn und unten von der Medulla hinter der durchscheinenden Duralmembran umrandet wird (Abbildung 1B und 1C).
   10. Wischen Sie mit einem chirurgischen Augenspeer oder Wattestäbchen über die Duramembran, die das CM bedeckt.
2. Einführen der Kanüle in die CM
   1. Entfernen Sie die Kanüle aus der mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) gefüllten Spritze, wobei Sie die 30G-Nadel am hinteren Ende des Schlauchs befestigen lassen.
   2. Befestigen Sie die 30G-Nadel an einer mit destilliertem Wasser gefüllten 100-μl-Spritze, die an eine Spritzenpumpe angeschlossen ist.
   3. Führen Sie eine Luftblase von ca. 1 cm Länge in die Kanüle ein, indem Sie mit Hilfe einer Spritzenpumpe Luft absaugen.
   4. Ziehen Sie mit einer Spritzenpumpe 12 μl des gewünschten Liquors (CSF) in die Kanüle zurück.
   5. Fassen Sie die Kanüle, die mit dem Liquormarker gefüllt ist, in der Nähe der mit dem Schlauch bedeckten Nadel mit einer gebogenen Pinzette, die Sie in der dominanten Hand halten. Legen Sie den Mittelfinger der nicht-dominanten Hand auf die Ohrstange der gegenüberliegenden Seite und halten Sie ihn für die spätere Verwendung als Auflage für die Kanüle fest.
   6. Führen Sie die Kanüle in einem Winkel von 45° relativ zum Mauskopf ein und führen Sie sie in die Mitte des CM ein, der durch seine dreieckige Ausrichtung durch die Dura sichtbar ist. Vermeiden Sie ein Eindringen in das Kleinhirn oder das Mark. Achten Sie darauf, dass die Nadel nur bis zu einer Tiefe von 1 - 2 mm eingeführt wird, z. B. bis zu dem Punkt, an dem die Fase vollständig unter der Dura liegt. Lassen Sie die Pinzette, mit der sich die Kanüle befindet, los und lassen Sie die Kanüle auf der nicht dominanten Hand ruhen.
      HINWEIS: Das abgeschrägte Ende der Zahnnadeln erfordert eine gewisse Kraft, um die Duralmembran zu durchstechen, die das CM bedeckt.
   7. Trocknen Sie bei Bedarf ein eventuelles Liquorleck beim Eindringen mit einem chirurgischen Augenspeer oder Wattestäbchen ab.
   8. Tragen Sie 2-3 Tropfen Cyanacrylatkleber auf die Duralmembran auf, die die Kanüle umgibt. Füge einen Tropfen Leimbeschleuniger hinzu, um den Kleber sofort auszuhärten. Bedecken Sie den Schädel und die Nadel mit einer Mischung aus Zahnzement (ca. 0,5 mg) und Cyanacrylatkleber (3 - 5 Tropfen). Tragen Sie unmittelbar danach einen Tropfen Leimbeschleuniger auf, um auszuhärten.

Ergebnisse

Abbildung 1: Injektion von Tracern in die Cisterna magna. (A) Schematische Übersicht des Mauskopfes und des Gehirns, die die Lage der Cisterna magna (CM) in Bezug auf das Gehirn und die Schädelstrukturen zeigt. (B) Mikro...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SOPIRA carpule 30G 0,3 x 12 mm	Kulzer	AA001 Chlorhexidin
0,5% (Chlorhexidindigluconat)	Meda AS		http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
Alkoholtupfer 70% Isopropylalkohol 30 x 60 mm	Vitrex Medical A/S	520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha	Ophtha Ophtha	145250
Holzapplikator, doppeltes Wattestäbchen (Ø ca. 4 - 5 mm, Länge ca. 12 mm)	Heinz Herenz	1032018
Augenspeere	Medicom	A18005
Kimtech Science Präzisionstücher Taschentuchwischer	Kimberly Clark Professional	5511
Loctite Sekundenkleber Präzision 5 g	Loctite		http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html
Insta-Set CA Beschleuniger	Bob Smith Industries	BSI-152
Zahnzementpulver	A-M Systems	525000
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 0,01 M; pH 7,4)	Sigma Aldrich	P3813
Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Konjugat	Thermo Fisher Scientific	O34784
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) Lösung (1 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	62248
Dextran, Fluorescein, 3000 MW, anionisch	Thermo Fisher Scientific	D3305
Ketaminol Vet 100 mg/mL (Ketamin)	Intervet International BV	511519
Rompin Vet 20 mg/mL (Xylazin)	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
Xylocain 20 mg/mL (Lidocain)	AstraZeneca	158543
Marcain 2,5 mg/ml (Bupivacain)	AstraZeneca	123918
Bupaq Vet 0,3 mg/ml (Buprenorphin)	Richter Pharma AG	185159