Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
1. Markierte Zellinjektion in das Gehirn-Organoid
HINWEIS: Für diese Arbeit wurden zerebrale Organoide mit einem kommerziellen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Dieses kann durch das zerebrale Organoid von Interesse ersetzt werden. Die in diesem Teil des Protokolls verwendeten Materialien müssen vorgekühlt werden, um ein Gelieren der löslichen Basalmembranmatrix bei Temperaturen über 4 °C zu vermeiden.
- Platzieren Sie die Insulinspritze(n), -spitzen und -röhrchen, die mit der löslichen Basalmembranmatrix in Kontakt kommen werden, bei -20 °C, um sie abkühlen zu lassen.
- Tauen Sie ein Aliquot der gelösten Basalmembranmatrix geeigneter Größe auf Eis auf, abhängig von der Anzahl der durchzuführenden Injektionen (~2 μL/Injektion). Dies dauert ca. 30 Minuten.
- Während das Aliquot auftaut, spalten, ernten und zählen Sie die Zellen.
- Berechnen Sie die pro Injektion benötigten Volumina. Wenn Sie mehrere Injektionen durchführen, geben Sie das Gesamtvolumen der Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie bis zu 1 ml DMEM/F12.
HINWEIS hinzu: Es sollte ein Volumen verwendet werden, das einige zusätzliche Injektionen ermöglicht, um Verluste/Pipettierfehler zu berücksichtigen. - Legen Sie die Zellen in Eis, während die nächsten Schritte vorbereitet werden.
- Nach dem Auftauen verdünnen Sie die solubilisierte Basalmembranmatrix auf eine Endkonzentration von 3 mg/ml in eiskaltem DMEM/F12.
- Nehmen Sie die einzellige Suspension aus dem Eis und schleudern Sie sie bei 300 × g für 5 min bei 4 °C herunter.
HINWEIS: Wenn keine gekühlte Zentrifuge zur Verfügung steht, scheint das Schleudern bei Raumtemperatur im Allgemeinen toleriert zu werden. - Entfernen Sie das Medium vorsichtig und vollständig, ohne das Küvettenpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch vorsichtiges Pipettieren in der verdünnten solubilisierten Basalmembranmatrix (3 mg/ml), um ein endgültiges Volumen von 2 μl pro durchzuführender Injektion zu erhalten, und legen Sie es sofort wieder auf Eis, bis es verwendet wird.
HINWEIS: Die Resuspension der Zellen muss langsam und mit vorgekühlten Spitzen durchgeführt werden, um die Bildung von Blasen und Gelierung zu vermeiden. - Übertragen Sie die vorgekühlte(n) Spritze(n) aus dem -20 °C-Gefrierschrank in einen Eiskübel. Bewahren Sie sie dort auf, bis sie verwendet werden.
- Nehmen Sie die Platte mit den Gehirn-Organoiden aus dem Inkubator. Verwenden Sie eine Spitze mit breiter Bohrung, um das Organoid, das injiziert werden soll, in eine 35-mm-Schale zu übertragen. Entfernen Sie das gesamte Medium, ohne das Organoid zu beschädigen, um es zu stabilisieren und die Injektion zu erleichtern.
HINWEIS: Es ist wichtig, Spitzen mit breiter Öffnung zu verwenden, um eine Zerstörung des Organoids zu vermeiden. Wenn sie nicht verfügbar sind, schneiden Sie das Ende einer normalen P1.000-Spitze mit einer sterilen Schere ab. - Stellen Sie die 35-mm-Schale mit dem Organoid unter ein Präpariermikroskop, um die Injektion zu führen und zu erleichtern.
HINWEIS: Wenn kein Präpariermikroskop in einem sterilen Bereich verfügbar ist, ist es möglich, die Injektion ohne eines durchzuführen, wenn auch mit etwas eingeschränkter Kontrolle. Eine weitere Alternative ist die Verwendung einer Vergrößerungsschlaufe oder einer Brille. - Sobald das/die Organoid(e) zur Injektion bereit sind, resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer gekühlten P20-Pipettenspitze und geben Sie 2 μl (mit der gewünschten Anzahl von zu injizierenden Zellen) auf einen vorgekühlten sterilen Objektträger.
HINWEIS: Bei Mehrfachinjektionen kann ein zusätzliches Volumen von 2 μl über den Objektträger hinzugefügt werden. Bewahren Sie es auf Eis auf und achten Sie darauf, dass es nicht verdunstet. - Nehmen Sie eine vorgekühlte Insulinspritze aus dem Eis und ziehen Sie die 2 μl Zellsuspension langsam mit der Abschrägung der Nadel nach unten auf, damit alle Zellen/das Medium aufgenommen werden können.
HINWEIS: Achten Sie darauf, extrem langsam zu fahren, um das Ansaugen von Luft zu vermeiden. - Öffnen Sie den Deckel der Schale, in der sich das Organoid befindet, und fokussieren Sie das Mikroskop darauf. Halten Sie die Schüssel mit einer Hand fest. Platzieren Sie die Fase der Nadel nach oben und injizieren Sie mit der anderen Hand die Zellen langsam in die Organoidoberfläche.
HINWEIS: Es ist wichtig, langsam zu injizieren, um eine Schädigung des Gewebes zu vermeiden. - Setzen Sie nach der Injektion den Deckel wieder in die Schale ein und lassen Sie das injizierte Organoid 1-2 Minuten einwirken
HINWEIS: Dadurch kann die verdünnte, lösliche Basalmembranmatrix gelieren und die Zellen an Ort und Stelle halten. Wird das Medium zu früh zugegeben, kann es die an der Oberfläche sitzenden Zellen wegspülen. - Geben Sie vorsichtig 500 μl des Organoidmediums hinzu und überführen Sie das Organoid mit einer Spitze mit breiter Bohrung in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubieren Sie das Organoid über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2. Führen Sie jeden zweiten Tag einen vollständigen Mediumwechsel durch.
HINWEIS: Es ist wichtig, ein Negativkontrollorganoid (Mock-Injected) beizufügen, das für bildgebende Anpassungen verwendet wird. Zu diesem Zweck wird ein Organoid wie zuvor beschrieben mit verdünnter solubilisierter Basalmembranmatrix (3 mg/ml) injiziert, um ein Endvolumen von 2 μl ohne Zellen zu erhalten.