Quantifizierung bakterieller infektionsinduzierter Amyloide mittels Thioflatin-T-Fluoreszenz

Zusammenfassung

Quelle: Balczon, R., et al. Verfahren zum Nachweis zytotoxischer Amyloide nach Infektion von Lungenendothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt das Protokoll zur Quantifizierung von Amyloiden in Kulturüberständen aus Lungenendothelzellen, die mit virulenten Bakterien infiziert sind, unter Verwendung von Thioflavin T, einem Fluoreszenzfarbstoff, der an Amyloid-Beta-Faltblattstrukturen bindet. Ein Anstieg der Fluoreszenz im Vergleich zum Ausgangswert deutet auf das Vorhandensein von Amyloiden im Kulturüberstand hin.

Protokoll

1. Analyse zytotoxischer Überstände

1. Um einen Thioflavin-T (ThT)-Assay durchzuführen, verwenden Sie die ThT-Fluoreszenz, um Amyloide in Überständen zu quantifizieren. Verwenden Sie für diese Messungen filtersterilisierte Überstände.
   1. Bereiten Sie eine Stammlösung (50x) ThT vor, indem Sie 8 mg ThT in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendieren. Nach dem Mischen wird die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter filtriert, um Partikel zu entfernen.
   2. Für Messungen fügen Sie 20 μl ThT-Rohmaterial zu 1 ml PBS in einer 1 ml-Spektralphotometer-Küvette hinzu. Geben Sie die verdünnte Probe in ein Spektrofluorometer.
   3. Messen Sie die Fluoreszenzemission der Basislinie mit 425-nm-Anregung und scannen Sie die Fluoreszenzemission von 450-575 nm in 2-nm-Schritten.
   4. Führen Sie einen Zeitrafferscan mit 425 nm Anregung und 482 nm Emission durch, wobei die Daten 60 s lang alle 0,2 s erfasst werden.
   5. Die ersten 20 s des Zeitrafferscans messen die Fluoreszenz in der Blankoküvette. Nach 20 s unterbrechen Sie den Scanvorgang und geben Sie 10 μl des filtersterilisierten Überstands in die Küvette. Mischen Sie die Küvette durch Inversion und setzen Sie sie dann wieder in das Spektrofluorometer ein.
   6. Setzen Sie den zeitbasierten Scan fort und erfassen Sie die letzten 40 s an Daten.
   7. Führen Sie nach Abschluss des Zeitrafferscans einen abschließenden Fluoreszenzemissionsspektrum-Scan mit identischen Einstellungen durch, wie in Schritt 1.3 beschrieben.

Materialien