Coinkubationsassay zur Untersuchung kompetitiver Wechselwirkungen zwischen Bakterienstämmen

Zusammenfassung

Quelle: Speare, L., et al. Coinkubationsassay zur Quantifizierung kompetitiver Wechselwirkungen zwischen Vibrio fischeri Isolaten. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt einen Co-Inkubations-Assay, mit dem untersucht wird, wie Bakterienstämme in einer gemeinsamen Umgebung konkurrieren. Es wird in der Mikrobiologie häufig eingesetzt, um Mechanismen wie die kontaktabhängige oder kontaktunabhängige Abtötung zu identifizieren, die diese Wechselwirkungen antreiben.

Protokoll

1. Coinkubierende Stämme (Abbildung 1B, C)
   1. Mischen Sie den Referenzstamm und den Stamm der Mitbewerber in einem Verhältnis von 1:1 (v/v), indem Sie 100 μl jedes Stammes (normiert auf OD 1,0) in ein beschriftetes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Mischen Sie als Kontrolle den Referenzstamm mit einer differentiell getaggten Version von sich selbst (Referenzstamm pVSV102 + Referenzstamm pVSV208). Diese Kontrolle ist für eine spätere statistische Analyse erforderlich, um festzustellen, ob das Vorhandensein eines Konkurrenzstamms das Wachstum des Referenzstamms beeinflusst. Die gemischte Stammkultur 1-2 s lang vortexen.
      ANMERKUNG: Dieser Schritt muss möglicherweise optimiert werden, da das Startverhältnis die Ergebnisse erheblich beeinflussen kann und möglicherweise angepasst werden muss.
   2. Wiederholen Sie Schritt 1 für jedes biologische Replikat. Nach Abschluss dieses Schritts sollten insgesamt acht Röhrchen mit gemischten Stämmen vorhanden sein: vier biologische Replikate mit differentiell markierten Referenzstämmen (Kontrolle) und vier biologische Replikate mit differentiell markierten Referenz- und Konkurrenzstämmen (experimentell).
   3. 10 μl jeder Kontroll- und Versuchsmischung werden auf Petriplatten mit LBS-Agar aufgebracht; Diese Kulturspots werden nach der Inkubation für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet.
   4. Lassen Sie die Spots auf der Bank vollständig trocknen, bis die gesamte Flüssigkeit in den Agar aufgenommen wurde, und inkubieren Sie die Petriplatten bei 24 °C für 24 h. Für V. fischeri-Stämme , die mit pVSV102 und pVSV208 markiert sind, sind mindestens 15 h erforderlich, um auf eine ausreichend hohe Zelldichte zu wachsen, um grün fluoreszierendes Protein (GFP) bzw. rot fluoreszierendes Protein (RFP) auf Populationsebene mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen. Hier verwenden wir eine 24-stündige Inkubation für die Abbildung von gemischten Flecken.
      ANMERKUNG: Es ist wichtig, Platten zu verwenden, die nicht zu feucht oder zu trocken sind. Wenn die Platten zu feucht sind, werden die Coinkubationsflecken nicht von der Agarplatte absorbiert; Vermeiden Sie die Verwendung von Tellern, die am selben Tag gegossen werden. Wenn die Platten zu trocken sind, können sich kleine Wellen oder Risse auf der Agaroberfläche bilden, die die Form der Münzflecken unregelmäßig machen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Flussdiagramm zur Veranschaulichung des Coinkubationsassays. (A) Bakterienstämme, die entweder pVSV102 (Referenzstamm als Ref.-Stamm oder R.S. bezeichnet) oder pVSV208 (Konkurrenzstamm als Comp.-Stamm oder C.S. bezeichn...

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