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1. Beschichtungs-Assay
ANMERKUNG: Der Plattierungsassay misst die Konzentration von Zellen, die in der Lage sind, eine koloniebildende Einheit (KBE) in den Kulturproben zu erzeugen. Dieses Verfahren zeigt die Geschwindigkeit, mit der sich eine Zelle in zwei lebensfähige Zellen teilt, und ermöglicht den Nachweis von Zellteilungsstopps (z. B. eine Erhöhung der bakteriellen Generationszeit der Zelllyse).
- Bereiten Sie 10-fache Serienverdünnungen bis zu 10-7 der 200 μl Kulturprobe in frischem Medium vor. Platte 100 μl der entsprechenden Verdünnung auf nicht-selektiven Luria-Bertani (LB) Agaroseplatten, um nach einer Inkubation über Nacht bei 37 °C zwischen 3 und 300 Kolonien zu erhalten.HINWEIS: Die serielle Verdünnung in frischem Medium muss schnell durchgeführt werden, um die bakterielle Teilung zu begrenzen. Alternativ könnten Forscher in Betracht ziehen, eine Kochsalzlösung ohne Kohlenstoffquelle zu verwenden, um Zellteilungen während des Verdünnungsprozesses zu verhindern.
- Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien, um die Konzentration lebensfähiger Zellen (KBE/ml) in jeder Kulturprobe zu bestimmen. Die KBE/ml ist als Funktion der Zeit für unbehandelte und behandelte Zellkulturen darzustellen.
2. Durchflusszytometrie
ANMERKUNG: Der folgende Abschnitt beschreibt die Vorbereitung von Zellproben für die durchflusszytometrische Analyse. Diese Analysetechnik zeigt die Verteilung der Zellgröße und des DNA-Gehalts für eine große Anzahl von Zellen. Wenn möglich, wird empfohlen, die Durchflusszytometrie-Proben sofort zu verarbeiten. Alternativ können die Proben auf Eis aufbewahrt werden (bis zu 6 Stunden) und am Ende des Tages gleichzeitig analysiert werden, nachdem die Plattierung und die Mikroskopie durchgeführt wurden.
- Verdünnen Sie die 250 μl der Kulturprobe, um 250 μl bei einer Konzentration von ~15.000 Zellen/μl (entsprechend einem OD600 nm ~ 0,06) in frischem Medium bei 4 °C zu erhalten.
ANMERKUNG: Die Inkubation auf Eis wird das Wachstum und die morphologische Veränderung der Zellen begrenzen. Alternativ kann der Benutzer eine Fixierung der Zellen in 75%igem Ethanol in Betracht ziehen, wie es normalerweise für die Durchflusszytometrie empfohlen wird. - Für die DNA-Färbung mischen Sie die Bakterienprobe mit einer 10 μg/ml-Lösung des DNA-Fluoreszenzfarbstoffs (Verhältnis 1:1) und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln, bevor Sie die Probe analysieren.
- Geben Sie die Probe mit einer Durchflussrate von ~120.000 Zellen/min in das Durchflusszytometer. Erfassen Sie vorwärts gestreutes (FSC) und seitlich gestreutes (SSC) Licht sowie DNA-Fluoreszenzfarbstoff-Fluoreszenzsignal (FL-1) mit den entsprechenden Einstellungen.
- Stellen Sie die FSC- und FL-1-Zelldichte-Histogramme dar, um die Verteilung der Zellgröße und des DNA-Gehalts in der Zellpopulation darzustellen.