Elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway der D. melanogaster</em

Zusammenfassung

The Giant Fiber System ist eine einfache neuronale Schaltkreis der Erwachsenenbildung Drosophila melanogaster Mit dem größten Neuronen in-the-fly. Wir beschreiben das Protokoll für die Überwachung der synaptischen Übertragung über diesen Weg durch die Aufnahme postsynaptischen Potentiale in dorsalen Längs-(DLM) und tergotrochanteral (TTM) Muskeln folgende direkte Stimulation des Riesengebirges Fiber Interneuronen.

Zusammenfassung

Wenn erschrocken erwachsenen D. melanogaster reagieren durch einen Sprung in der Luft und fliegen weg. In vielen wirbellosen Arten, darunter D. melanogaster, Reaktion der "Flucht" (oder "erschrecken") während der erwachsenen Stadium wird durch die Multi-Komponenten neuronalen Schaltkreis namens the Giant Fiber System (GFS) vermittelt. Die vergleichende Größe der Neuronen, ihre markante Morphologie und einfache Connectivity machen die GFS ein attraktives Modell für die Erforschung von neuronalen Schaltkreisen. Die GFS-Weg besteht aus zwei bilateral symmetrisch Riesen Fiber (GF) Interneurone, deren Axone steigen aus dem Gehirn entlang der Mittellinie in der Brust-Ganglion über den zervikalen Bindegewebe zusammen. In der mesothoracic Neuromer (T2) der ventralen Ganglien der GF Form elektro-chemischen Synapsen mit 1) der großen medialen Dendriten der ipsilateralen Motoneuron (TTMn), die die tergotrochanteral Muskel-Laufwerke (TTM), die wichtigsten extensor für die mesothoracic Femur / Bein und 2) der kontralateralen peripher Synapsen Interneuron (PSI), die wiederum bildet chemische (cholinerge) Synapsen mit den Motoneuronen (DLMns) der dorsalen Längsmuskeln (DLMS), die Flügel Senker. Sie sind nicht direkt an den Flügeln befestigt, sondern bewegen Sie den - Die Nervenbahn (s) zum dorsovental Muskeln (DVMs), die Flügel Aufzüge, wurde noch nicht durchgeführt (die DLMs und DVMs werden gemeinsam als indirekte Flugmuskeln bekannt war Flügel indirekt durch eine Verzerrung der Nähe Thorax Kutikula) (König und Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). Die di-synaptischen Aktivierung des DLMs (via PSI) führt zu einer kleinen, aber wichtigen Verzögerung in der Zeitpunkt der Kontraktion dieser Muskeln gegenüber dem monosynaptische Aktivierung von TTM (~ 0,5 ms), wodurch die TTMS zum ersten Verlängerung des Oberschenkelknochens und treiben den Fliege aus dem Boden. Die TTMS gleichzeitig Stretch-Aktivierung der DLMs die wiederum gegenseitig Stretch-Aktivierung der DVMs für die Dauer des Fluges. Die GF-Weg kann entweder indirekt durch die Anwendung einer sensorischen (z. B. "air-puff" oder "Lichter-off") Stimulus aktiviert werden, oder direkt durch eine supra-Schwelle elektrische Impulse an das Gehirn (hier beschrieben). In beiden Fällen erreicht ein Aktionspotential das TTMS und DLMs ausschließlich über die GFS, PSI und TTM / DLM Motoneuronen, obwohl die TTMns und DLMns haben andere, bisher nicht identifizierten, sensorische Eingänge. Messen "Latenzzeit" (die Zeit zwischen der Stimulation und Muskelschmerzen Depolarisation) und die "folgenden hochfrequente Stimulation" (die Zahl der erfolgreichen Reaktionen auf eine bestimmte Anzahl von Hochfrequenz-Stimuli) bietet eine Möglichkeit, reproduzierbar und quantitativ beurteilen den funktionellen Status der GFS-Komponenten, einschließlich zentraler Synapsen (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) und der chemischen Industrie (glutamatergen) neuromuskulären Synapsen (TTMn-TTM und DLMn-DLM). Es wurde verwendet, um Gene in zentralen Synapsenbildung beteiligt zu identifizieren und ZNS-Funktion zu beurteilen.

Protokoll

1. Ausrüstung und Materialien

1. Diese Experimente mit einem Standard-Elektrophysiologie Aufbau eines Stimulators, einen Stimulus Isolation Unit, zwei Mikroelektroden-Verstärker, ein Datenerfassungssystem und ein Computer mit Sammlung Software enthält. Zusätzliche Ausstattung gehören ein Faraday-Käfig, ein Stereomikroskop auf einem Galgen, eine Schwingungsisolation Tisch, eine Lichtquelle und eine Aufnahme-Plattform.
2. Fünf Mikromanipulatoren verwendet werden. Zwei Mikromanipulatoren erfordern feine Steuerungen für die Positionierung der Aufnahme Elektroden, während die anderen drei Mikromanipulatoren nur grobe Steuerung benötigen, um die beiden Stimulationselektroden und der Masseelektrode Position. Der Mikromanipulator für die DLM Aufnahme Elektrode ist am hinteren Ende der Vorbereitung gelegt (links Experimentator) und der Mikromanipulator für die TTM Aufnahme Elektrode wird zwischen dem Experimentator und der Seite der Zubereitung (leicht nach links von der Experimentator) platziert. Die beiden Mikromanipulatoren, dass die Simulation Elektroden halten werden, sind an der Spitze der Zubereitung (rechts Experimentator) platziert. Der Mikromanipulator für die Masse-Elektrode wird auf der anderen Seite der Zubereitung gelegt
3. Pull Glas Aufnahme Mikroelektroden mit Widerständen von 40-60 MOhm und speichern in einer Schale mit Wachs unterstützt flach. Zur Stimulation werden zwei elektrolytisch (NaOH) geschärft Wolframelektroden verwendet. Ein Wolfram-Draht, oder eine dritte elektrolytisch hergestellt Elektrode wird als Grund benutzt. Die anregende und Masseelektroden sind vorbereitet und an der Mikromanipulatoren vor Beginn der experimentellen Sitzung und müssen nicht für die Dauer der Sitzung ausgetauscht werden.

2. Vorbereiten des D. melanogaster

1. Sobald Ihr Gerät eingerichtet ist, ist es Zeit, die Fliegen vorzubereiten. Anesthetize die Fliegen durch Kühlung auf ihnen Eis oder mit CO _2. Wenn CO ₂ verwendet wird, dann genügend Zeit (ca. 20 Minuten) für die Auswirkungen des Gases zu tragen off vor Beginn des Experiments.
2. Verwenden einer Pinzette, um die Fliegen leicht übertragen durch ihre Beine, um eine Schale mit einer Plattform von weichem Wachs geneigt in einem Winkel von etwa 45 °. Die nächsten vier Schritte werden unter einem Binokular entfernt (aber in der Nähe) das Kontrollgerät erfolgt.
3. Der nächste Schritt ist die Fliege in Wachs zu sichern. Orient-the-fly Bauchseite nach unten, mit seiner vorderen Seite nach oben auf die Piste. Mit einer feinen Pinzette, verlängern die Beine nach außen, in Paaren, und schieben Sie sie in das Wachs.
4. Machen Sie sich mit der Lage der Muskeln aus erfasst werden: die dorsale Längsmuskulatur oder DLM und der tergotrochanteral Muskeln oder TTM. Die subkutanen Bindungsstellen des DLMs mit der Region zwischen Brust-Mittellinie und der vorderen Rückenflosse Borsten (oder Borsten) entsprechen. Die TTM Bindungsstellen sind dorsal der hinteren und vorderen supra-alar Borsten entfernt. Sicherzustellen, dass die Flügel nicht behindern den Zugang zu den DLM oder TTM Fasern halten die Flügel nach außen und "Leim" sie, um das Wachs.
5. Mit einem feinen Pinzette, ziehen Sie den Rüssel nach außen sorgfältig, und sichern Sie sie durch Eintauchen in das Wachs. Dies ist ein entscheidender Schritt, der einige Übung erfordert, da der Rüssel ist weich und lässt sich leicht vom Rest des Kopfes getrennt. Wenn das passiert, werfen Sie die fliegen und von vorn beginnen. Die Nichtbeachtung der Kopf auf diese Weise sichere führt zu Problemen beim Einlegen der stimulierenden Elektroden durch die Augen.

3. Platzierung der Elektroden

1. Sobald die fliegen, um das Wachs verankert ist, übertragen Sie die Schüssel mit dem beigefügten fliegen unter dem Stereomikroskop, dass im Inneren des Faradayschen Käfigs befindet. Orient-the-fly im Querformat mit dem Kopf der Fliege auf der rechten Seite des Experimentators.
2. Der nächste Schritt ist es, die Elektroden legen. Grund-und Stimulationselektroden können, ohne sich durch das Mikroskop eingesetzt werden. Gute Aufnahmen verlassen sich auf präzise impalement, so ist es eine gute Idee zur Praxis der Handhabung des Mikromanipulatoren. Bringen Sie die Elektroden in der Nähe der Standorte der Insertion mit Hilfe von Mikromanipulatoren, um ihre richtige Platzierung und die anschließende Aufnahmen zu erleichtern.
3. Senken Sie die Masse-Elektrode in das hintere Ende des Bauches mit der Anpassung Räder auf dem Mikromanipulator. So platzieren Sie den geschärften Wolfram stimulierenden Elektroden im Gehirn, die Mikromanipulator an der Spitze einer der Elektroden so zu positionieren, es berührt nur eine Fliege in die Augen. Machen Sie dasselbe mit den anderen, so dass beide Elektroden nur berühren der Außenseite jedes Auge. Dann drücken Sie die Elektroden, die wiederum durch jedes Auge, so dass die Spitzen der Elektroden erreichen das Gehirn an der Rückseite des Kopfes Kapsel (ca. 2-3mm) gelegen.
4. Richtig platziert Elektroden aktiviert die Riesen-Fiber System. Um zu testen, dass die stimulierenden Elektroden richtig platziert sind, tragen Sie eine kurze (0,03 ms) Reiz von 30-60 V über die stimulierenden Elektroden, und suchen Sie nach Bewegung der Flügel und Zuckungen des Fluges / Beinmuskel "
5. Der nächste Schritt ist die Back-füllen das Glas-Mikroelektroden mit 3M KCl mit einer Hamilton-oder Wärme-gezogen Plastikspritze, und legen Sie sie in die feine Kontrolle Mikromanipulatoren. Richtig eingesetzt Mikroelektroden können für mehrere Runden von Experimenten verwendet werden.
6. Die erste Aufnahme-Elektrode wird in eine DLM-Faser eingesetzt werden. Es gibt zwei bilateral symmetrische DLMs, jeder besteht aus sechs einzelnen Muskelfasern zusammen. Die Aufnahmen können von jedem der sechs Fasern gemacht werden, aber die am häufigsten verwendeten sind DLM Fasern 45a und 45b aufgrund ihrer guten Erreichbarkeit über die Rückenseite des Thorax Kutikula, und die Tatsache, dass beide Fasern, die durch die gleiche Motoneuron innerviert .
7. Mit dem Mikromanipulator auf der Seite von Ihnen am weitesten, legen Sie eine Aufzeichnung Elektrode in DLM-Faser 45a oder b. Die Steigung der Plattform ermöglicht die DLM Elektrode an der dorsalen Kutikula bei ~ 60-90 ° Winkel, die das Eindringen Hilfen geben. Verwenden Sie die Software im Oszilloskop-Modus und Blick auf den Computermonitor beim Einsetzen der Aufnahme Elektroden in den Brustkorb. Wenn die Elektrode hat ein Muskel in die Baseline wird auf nahe Null oder einen negativen Wert sinken. Testen Sie mit einem einzigen Reiz zu sehen, wenn Sie die Reaktion des Muskels beobachten können.
8. Stecken Sie das andere Aufnahme-Elektrode in die TTM in Ihrer Nähe. Diese Elektrode ist seitlich, vor Ihnen eingefügt, aufgrund der Lage des Muskels Anheftungsstelle. Wieder beobachten Sie den Monitor, während Sie diese und testen Sie mit einem einzigen Reiz, wenn die Spur zeigt die Elektrode in den Muskel.

4. Stimulation und Recording

1. Sie sind nun bereit zu beginnen Stimulation des Gehirns und Aufzeichnung Antworten aus dem Bein und Flugmuskulatur. Tragen Sie eine kurze (0,03 ms) Stimulus über die stimulierenden Elektroden ab 30 V und die Erhöhung auf 60 V, bis Sie eine Antwort zu beobachten (dh ein Muskel zucken, und einer Muskelzelle Depolarisation wie auf dem Computer-Monitor beobachtet). Für den Rest des Experiments, stellen Sie die Spannung 5-10 V oberhalb der Ansprechschwelle.
2. Zur Messung Reaktionslatenz, geben mindestens 5 einzelne Reize mit einem 5 Sekunden Pause zwischen jedem Reiz.
3. Bestimmen Sie die "Häufigkeit der folgenden" durch Züge von Reizen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. In der Regel 10 Züge von 10 Stimuli bei 100Hz (10ms zwischen jedem Reiz) gegeben, 200Hz (5ms zwischen den einzelnen Reiz) und 300Hz (3 ms zwischen den einzelnen Stimulus). Lassen Sie eine Ruhezeit von 2 Sekunden zwischen jedem Zug von Reizen.

5. Ergebnisse: Response Latenzen und Häufigkeit der Nach in the Giant Fiber Pathway

1. Die Antwort Latenz ist die Zeitspanne zwischen Stimulation des Gehirns und Depolarisation des Muskels. Diese Zahl vergleicht die Reaktion Latenzen für DLM und TTM auf einen einzigen Reiz. Latenzen zwischen 0,7 und 1,2 ms für die GF-TTM Weg und zwischen 1,3 und 1,7 ms für die GF-DLM Weg weisen auf eine gesunde Zubereitung und richtige Aufnahmetechnik. Die Latenzen können mit Genotyp, genetischem Hintergrund, Temperatur und Alter variieren.
   
   Abbildung 1 (A und B). Representative Spuren, Antworten aus dem TTMS und DLMs nach einer einmaligen Reiz Einwirkung auf das Gehirn aufgezeichnet.
2. Wie hier gezeigt, zeigen Aufnahmen von der TTM mehr Variabilität in Bezug auf die Amplitude und die Form des postsynaptischen Potentials (PSP) im Vergleich zu denen von den großen DLM Fasern; diese erhöhte Variabilität ist aufgrund der geringen Größe des TTM Muskelfasern. Diese Variabilität ist jedoch nicht auf die Reaktionslatenz Werte für die Riesen-Fiber-to-TTM Weg.
   
   Abbildung 1 (C und D). Weitere 'Reaktionslatenz "Spuren aus 4 einzelnen fliegt sowohl für die TTM und DLM. Hinweis TTM Spuren weisen Variabilität in PSP Form, sondern Reaktionslatenz bleibt davon unberührt. Für DLM gibt es weniger Variabilität in PSP Form.
   
   
   
   
3. Vergleichen Sie die "Häufigkeit der folgenden" bei 100 Hz, 200 Hz und 300 Hz durch die Berechnung des Anteils der erfolgreiche Antworten (von 10) für beide DLM und TTM Wege an jedem Stimulationsfrequenz. Bei 100 Hz, folgen beide TTM und DLM die Reize 1:1. Bei Anregung Frequenzen oberhalb von 100 Hz, starten Sie das DLM Reaktionen auf Störungen zeigen, weil der Vermittler chemischen Synapse zwischen zwei Interneuronen nicht genügend Zeit, um zwischen Reizen zu erholen. Die TTM Antworten, aber 1:1 mit Reizen auch über 300Hz bleiben.
   
   Abbildung 2. Representative Spuren, die "Häufigkeit der folgenden"-Aufnahmen. Bei 100Hz, beide TTMS und DLMs, um alle 10 Stimuli (links) zu reagieren. Bei 200Hz, starten Sie das DLM Antworten zu scheitern (Stern).
   
   
   
   

6. Repräsentative Ergebnisse

Wildtyp kurzer Latenz Antworten (stimulierten Elektroden sind in den Augen, unter Umgehung sensorischen Rezeptoren und die Auslösung der GF-Schaltung direkt) auf Genotyp, genetischem Hintergrund, Temperatur und Alter, und Bereich sind abhängig zwischen 0,7 und 1,2 ms für die GF-TTM-Weg und 1,3 and1.7 ms für die GF-DLM-Weg (Tanouye und Wyman, 1980; Thomas und Wyman, 1984; Engel und Wu, 1992; Allen und Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, unveröffentlicht.) . Diese sehr kurze Latenzzeit TTM ist aufgrund der robusten GF-TTMn elektrochemische Synapse der monosynaptische Weg und je länger DLM Latenz tritt auf, weil der disynaptic Natur des Weges sowie das Vorhandensein einer chemischen Synapse (PSI-DLMn). Intermediate-und lang-Latenz Reaktionen (> 3 ms) ergeben sich aus der Aktivierung des GF Afferenzen und sind entweder mit einer geringeren Intensität Stimulation oder eine visuelle ("light-off"-Signal) erzielt. Bei 100Hz sowohl TTM und DLM sollten folgen die Reize 1:1. Oberhalb 100Hz DLM Reaktionen beginnen zu Ausfällen zeigen, wie die chemischen Synapse zwischen PSI und der DLMns nicht genügend Zeit, um zwischen Reizen weniger als 10ms auseinander zu erholen. TTM Antworten, jedoch wird 1:1 mit Stimuli sogar darüber hinaus 300Hz (; Engel und Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007 Tanouye und Wyman, 1980) bleiben. Mutationen im Gen shakB, codierend ein Drosophila Gap Junction-Kanal ("innexin"), erhöhen die Response-Latenz des GF-TTM Weg (~ 1,5 ms), während die GF-DLM Zweig ist nicht mehr reagiert (Allen und Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). Die Mutante Antwort kann durch die Stimulierung Brustganglien direkt wiederhergestellt werden, die zeigen, dass der verzögerte Effekt nicht durch eine gestörte neuromuskuläre Übertragung. Die Fähigkeit, hochfrequente Stimulation folgen ist auch in diesen Mutanten im Vergleich zum Wildtyp fliegt, wo die GF-DLM und GF-TTM Wege sind in der Regel in der Lage bis 10 Reize mit Verhältnis 1:1 folgen bis zu 100 Hz und 300 Hz, bzw. beeinträchtigt wird. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Frequenzen deutlich über dem normalen Stimulation Frequenzen, die durch die Kontraktion von Muskeln während der anhaltenden Flucht (3-10 Hz) (Hummon und Costello, 1989) empfangen werden.

Ein weiterer Parameter verwendet werden, um die Stabilität des GFS-Ausgänge beschreiben, ist das "Refraktärzeit", oder die minimale Zeit zwischen twin Reizimpulse, die noch produziert zwei Antworten aus dem Muskel. Die feuerfeste variiert zwischen 1-4 ms für TTMS und 7-15 ms für DLMs. Die vergleichsweise lange Refraktärzeit für DLMs ist aufgrund der relativ labilen chemischen Synapsen an der PSI-DLMn Kreuzung (Tanouye und Wyman, 1980; Gorczyca und Hall, 1984; Engel und Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen und Godenschwege, 2010).

Diskussion

Eines der wichtigsten Dinge muss man achten, wenn sie versuchen, um qualitativ hochwertige Aufnahmen zu erhalten, ist die korrekte Ausrichtung und die Gesundheit der Vorbereitung. Idealerweise sollte die Fliege noch am Ende der Aufnahme-Session lebendig und reagiert auf elektrische Reize. Für die Aufnahme Elektroden möglichst effizient zu durchdringen der Brust-Exoskelett, sollte die Fliege an der Oberfläche so verklebt werden, um einen rechten Winkel mit den Elektroden bilden, falls erforderlich, das Einsetzen von Elektroden kann durch Entfernen eines Teils des erleichtert werden dorsalen Thorax Nagelhaut mit einem Wolfram-Skalpell damit Freilegung der DLM Flugmuskel (dieser Schritt bietet einen zusätzlichen Vorteil, dass es schwieriger für die Spitzen der Glaselektroden zu brechen). Außerdem muss die Sorgfalt zu vermeiden, schob die Elektroden durch die subcuticularly befindet DLMs und TTMS werden. Der Kopf der Fliege sollte gut gesichert werden, um für die stimulierenden Elektroden richtig in das Gehirn eingesetzt werden, zu ermöglichen und verhindern, dass sie zog während der Aufzeichnung.

Aufgrund seiner Größe und gut beschrieben Morphologie, stellt die GFS eine der am besten zugänglichen Nervenbahnen in Drosophila. Die Durchlässigkeit von elektrischen Synapsen zu kleinen Molekulargewicht Tracer Farbstoffe ermöglicht die Visualisierung von elektrisch gekoppelt Neuronen und mehreren verfügbaren GAL4 Linien machen es möglich, die unterschiedliche Expression in einer Untergruppe von Zellen oder Zellverbänden (Jacobs et al, 2000 zu manipulieren;. Allen et al., 2006) Zusätzlich zu den oben genannten Vorteile, sowohl afferente und Thorax-Komponenten der Schaltung Display Eigenschaften wie Gewöhnung, spontane Erholung und Dishabituation, so dass die Drosophila GFS eine bequeme Modellsystem für die Erforschung der neuronalen Plastizität (Engel und Wu, 1996).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NAMEN	UNTERNEHMEN	CAT. #	KOMMENTARE
S48 Rechteckimpuls Stimulator	Grass Instruments		http://www.grasstechnologies.com/
Stimulation Einheit	Grass Instruments		http://www.grasstechnologies.com/
SIU5 RF Transformer Isolation Unit	Grass Instruments		http://www.grasstechnologies.com/
5A Zwei-Kanal-Verstärker intrazelluläre Mikroelektroden	Erste Instruments		http://www.gettinginstruments.com/
Digidata 1440A Datenerfassungssystem	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Analog-Digital-Digidata 1320 und Axoscope 9.0 Software	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Recording-Plattform mit manueller Mikromanipulatoren	Narishige, Sutter Ins., World Precision Ins.		http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/
Lichtquelle	Fostec		http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm
Wilde M5 Stereomikroskop	Wild Heerbrugg		http://www.wild-heerbrugg.com/
Schwingungsisolierung Tabelle	TMC		http://www.techmfg.com/
Borosilikat-Schlauch für Mikroelektroden	Sutter Instrument		http://www.sutter.com/index.html
P-95 Micropipette puller	Sutter Instrument		http://www.sutter.com/index.html
Microfil 34 Gauge, 67 mm (Elektrode Füllstoff)	World Precision Instruments	MF34G-5	http://www.wpi-europe.com/en/
Mikrodissektion Werkzeuge (Zange, ...)	Feine Science Tools		www.finescience.com
Dissecting (Stereo)-Mikroskop	Leica		http://www.leica-microsystems.com/
Faraday-Käfig	Unbekannter Hersteller

Sonstiges: Kunststoffspritzen, Wolfram Schutzleiter und NaOH-geschärft Wolframelektroden, KCl, Wachs-Plattform, ein PC mit Monitor ...