Western Blot zur Beurteilung der strukturellen Integrität eines bakteriellen Impfstoffantigens

Zusammenfassung

Quelle: Gilmore, S. F. et al. Zellfrei skalierte Produktion und adjuvante Addition an ein rekombinantes Hauptprotein der äußeren Membran aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die Verwendung von Western Blotting zur Bewertung der strukturellen Integrität des wichtigsten äußeren Membranproteins (MOMP) in Nanopartikel-basierten Impfstoffkomplexen. Es werden die wichtigsten Schritte beim Proteintransfer, der Antikörpermarkierung und der Fluoreszenzbildgebung beschrieben.

Protokoll

1. Westlicher Blot

1. Für das Western Blotting lösen Sie das wichtigste äußere Membranprotein (MOMP) – Telodendrimer-Nanolipoprotein-Partikel (tNLPs) mittels SDS-PAGE auf und übertragen die Gele mit einem kommerziellen Dry-Blotting-System mit Standardeinstellungen gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   1. Entfernen Sie die Blots aus dem Stapel, nachdem der Transfer abgeschlossen ist, und inkubieren Sie jeden Blot über Nacht bei 4 °C in einem geeigneten Blockierungspuffer, der 0,2 % Tween 20 und entweder 0,5 mg/ml monoklonalen Antikörper (MAb) 40 oder 0,2 mg/ml MAbHIS-Anti-His-Tag-Antikörper enthält, der gegen den His-Tag aus dem Δ49ApoA1-Protein gerichtet ist.
      ANMERKUNG: Die für das Blotting verwendeten Antikörperverdünnungen betragen 1:1.000 für MAb40 und 1:500–1.000 für MAbHIS-Antikörper.
   2. Waschen Sie jeden Fleck 3 Mal für 5 min mit PBS-T (1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,2% Tween 20, pH 7,4).
   3. Inkubieren Sie die Blots 1 h lang in einem Blockierungspuffer, der einen Sekundärantikörper enthält, der an ein Fluorophor (z. B. Infrarotfarbstoff (IRDye)) in einer Verdünnung von 1:10.000 konjugiert ist.
   4. Waschen Sie die Tupfer 3 Mal für 5 Minuten mit PBS-T. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Imager, um die Blots nach der letzten Wäsche abzubilden.

Materialien