Adaptive Evolution von Bakterien mit Hilfe eines mikrobiellen Mikrotröpfchen-Kultursystems

Abstract

Quelle: Jian, X., et al., Automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution mit dem mikrobiellen Mikrotröpfchenkultursystem (MMC). J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video zeigt die Verwendung eines mikrobiellen Mikrotröpfchenkultursystems, um die adaptive Evolution von Bakterien in Richtung Methanoltoleranz voranzutreiben. Durch das Mischen von künstlich hergestellten Bakterienkulturen mit einem Stressmedium mit hohem Methanolgehalt und deren Segmentierung in Mikrotröpfchen wählt das System Mutanten aus, die unter Methanolstress ein verbessertes Wachstum aufweisen. Durch iterative Anreicherungszyklen und Kolonieisolierung werden methanolangepasste Bakterienstämme für die weitere Analyse oder Anwendung kultiviert.

Protocol

Adaptive evolution in MMC

1. Vorbereitung für die bakterielle Erstlösung
   1. Befolgen Sie die entsprechenden Normvorschriften, um die speziellen Flüssigmedium- und Feststoffplatten für den MeSV2.2 vorzubereiten und 15 min bei 121 °C zu autoklavieren.
   2. Kultivieren Sie den MeSV2.2 mit der massiven Platte (Durchmesser = 90 mm) in einem 37 °C Konstanttemperatur-Inkubator für 72 h. Wählen Sie dann ein unabhängiges Volk aus und kultivieren Sie es in einem 50-ml-Schüttelkolben mit 10 mL des speziellen flüssigen Mediums in einem Schüttelinkubator (200 U/min) bei 37 °C für 72 h.
   3. Die kultivierte MeSV2.2-Lösung wird mit dem Medium auf einen OD₆₀₀ von 0,1-0,2 verdünnt (es ist darauf zu achten, dass das Gesamtvolumen nicht weniger als 10 ml beträgt) und die Kultivierung im Schüttelkolben 5 Stunden lang fortsetzen, um die ursprüngliche Bakterienlösung zu erhalten.
      ANMERKUNG: Der MeSV2.2 ist ein Methanol-essentieller E. coli-Stamm . Das spezielle flüssige Medium enthält 500 mmol/L Methanol, was eine starke Belastung für MeSV2.2 darstellt und zu einem sehr langsamen Wachstum führt.
2. Initialisieren Sie die MMC.
3. Nehmen Sie zwei sterilisierte Reagenzflaschen heraus, von denen eine für die anfängliche Bakterienlösung und die andere für das frische Medium bestimmt ist. Injizieren Sie die anfängliche Bakterienlösung (5 ml), das frische Medium (12-15 mL) und das MMC-Öl in die Reagenzflaschen.
   ANMERKUNG: Da die adaptive Evolution ein langfristiger Prozess ist, der mehrere Unterkulturen umfasst, sollten Sie so viel frisches Medium wie möglich in MMC lagern. Das Medium kann während des Versuchs nicht nachgefüllt werden.
4. Setzen Sie die beiden Reagenzflaschen in MMC ein. Installieren Sie den für die anfängliche Bakterienlösung zwischen dem C2- und O2-Anschluss und den anderen für das Frischmedium zwischen dem C4- und dem O4-Anschluss.
5. Klicken Sie auf ALE, um die Funktion der adaptiven Evolution auszuwählen (Abbildung 1B). Schalten Sie in der Benutzeroberfläche für die Parametereinstellung den Schalter OD-Erkennung ein.

6. Stellen Sie die Zahl auf 50, die Wellenlänge auf 600 nm, die Konzentration auf 0 %, den Typ auf Zeit, den Parameter auf 30 h und die Wiederholungen auf 99 ein. Klicken Sie auf Start, um die Tröpfchengenerierung zu starten. Die Fahrt dauert ca. 25 Minuten.
   ANMERKUNG: Hier bezieht sich "Konzentration" auf die maximale Konzentration chemischer Faktoren für die adaptive Evolution. Für verschiedene Tröpfchen ist es in der MMC realisierbar, unterschiedliche Konzentrationen chemischer Faktoren einzuführen, um unterschiedliche Wachstumsbedingungen zu schaffen. Berechnen Sie die eingeführten Konzentrationen mit der folgenden Gleichung:

   

   Hier bezieht sich "C" auf die Konzentration chemischer Faktoren, die in Tröpfchen eingebracht werden; "a" bezieht sich auf die Konzentration chemischer Faktoren in den Reagenzflaschen zwischen dem C4- und dem O4-Anschluss; "b" bezieht sich auf die Konzentration chemischer Faktoren in den Reagenzflaschen zwischen dem C6- und dem O6-Anschluss; und "i" bezieht sich auf die verfügbare Konzentration. In MMC stehen acht Konzentrationen zur Verfügung. Da der chemische Faktor hier eine einzige Konzentration (500 mmol/L Methanol) hat und einer der Bestandteile des Mediums ist, wird hier nur eine Reagenzflasche mit dem chemischen Faktor installiert, und die Konzentration wird auf 0% festgelegt. Der Typ bezieht sich auf den Modus der Subkultivierung, der in drei Typen unterteilt ist: Zeitmodus, OD-Wertmodus und Fluoreszenzmodus. Ersteres bedeutet, die Tröpfchen für eine bestimmte Zeit zu kultivieren und dann zu subkultivieren, während die beiden letzteren bedeuten, die Tröpfchen auf einen vordefinierten OD-Wert/Fluoreszenzintensität zu kultivieren und dann zu subkultivieren. Parameter bezieht sich auf den zugehörigen Parameter, der bei der Auswahl einer Art der Unterkultivierung erforderlich ist. Wiederholungen beziehen sich auf die Anzahl der Unterkulturen.

7. Entfernen Sie die Reagenzflasche, die sich zwischen den C2- und O2-Anschlüssen befindet.
8. Beobachten Sie, ob die maximalen OD-Werte der Tröpfchen während jeder Subkultivierungsperiode signifikant gestiegen sind. Wenn die Erhöhung eintritt und die Anforderungen des Experiments erfüllt, klicken Sie auf die Schaltfläche Datenexport, um die OD-Daten zu exportieren.
   HINWEIS: Hier hängt der Zeitraum der Unterkultivierung vom Parameter ab. Wenn Sie beispielsweise Typ auf Zeit und Parameter auf 30 Stunden einstellen, beträgt die Unterkultivierungsperiode 30 Stunden. Während jeder Subkultivierungsperiode gibt es maximale OD-Werte der Tröpfchen. Schätzung, ob die adaptive Evolution die Versuchsanforderungen erfüllt, durch Erhöhung der maximalen OD-Werte (Die Erhöhung hängt vom tatsächlichen Kultivierungsprozess des Stammes ab, z. B. um mehr als 20 %). ACHTUNG: Achten Sie darauf, ob das gelagerte Frischmedium erschöpft ist. Wenn der signifikante Anstieg auch nach Erschöpfung des Mediums nicht eingetreten ist, extrahieren Sie die besser wachsenden Tröpfchen und führen Sie eine neue Runde der adaptiven Evolution durch.
9. Extrahieren Sie die Zieltröpfchen aus der MMC.
   1. Klicken Sie auf die Schaltfläche Screening, um die Funktion der Tröpfchenextraktion auszuwählen (Abbildung 1C). Wählen Sie die Option Sammeln, klicken Sie auf die Anzahl der Zieltröpfchen und dann auf OK.
      ANMERKUNG: Die Tröpfchensiebung umfasst "Sammeln", "Verwerfen" und "Saatgutlösung extrahieren". "Saatgutlösung extrahieren" bedeutet, dass die verbleibenden Tröpfchen nach der Unterkultivierung aufgefangen werden.
   2. Warten Sie, bis das Popup-Fenster die Meldung "Bitte ziehen Sie den CF-Schnellanschluss heraus und stecken Sie ihn in die EP-Röhre" anzeigt. Stecken Sie den CF-Schnellanschluss in das Mikrozentrifugenröhrchen, um es gemäß der Softwareaufforderung zu entnehmen, und klicken Sie dann auf OK (Abbildung 2D).
   3. Nach 1-2 Minuten öffnet sich auf der Softwareoberfläche ein neues Fenster mit der Aufforderung: "Bitte stecken Sie den Stecker wieder ein und klicken Sie auf OK, wenn Sie fertig sind". Stecken Sie dann den CF-Schnellanschluss wieder ein, und klicken Sie auf OK, damit MMC weiter ausgeführt wird (Abbildung 2D).
      ANMERKUNG: Nachdem alle Zieltröpfchen gesammelt wurden, fährt die MMC mit der Kultivierung der verbleibenden Tröpfchen fort. Wenn die Kultivierung nicht erforderlich ist, klicken Sie auf Stopp, um den Vorgang direkt zu beenden.
   4. Entnehmen Sie das Tröpfchen mit einer 2,5-μl-Pipette, lassen Sie es auf die 90-mm-Agaroseplatte fallen und verteilen Sie es gleichmäßig mit einem dreieckigen Glasspreizstab mit einer Seitenlänge von 3 cm. Kultivieren Sie sie dann 72 Stunden lang in einem Inkubator mit konstanter Temperatur bei 37 °C.
   5. Pflücken Sie 3-5 unabhängige Völker und kultivieren Sie sie separat in den 50-ml-Schüttelkolben mit 10 mL Frischmedium in einem Schüttelbrutschrank (200 U/min) bei 37 °C für 48-72 h. Befolgen Sie die entsprechenden Normvorschriften, um die kultivierte Bakterienlösung für nachfolgende Experimente im Glycerinröhrchen zu lagern.

Results

Abbildung 1: Bedienungssoftware-Schnittstelle von MMC. (A) Die Hauptschnittstelle der Software. (1) Temperatur in der Operationskammer. (2) Photoelektrischer Signalwert der Tröpfchenerkennung. Wenn der Tropfen durchgela...

Materials