Herstellung einer mikrofluidischen Platte mit bakteriellen Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Sutlief, A. L., et al. Live-Zell-Analyse der Scherspannung auf Pseudomonas aeruginosa mit einem automatisierten hochdurchsatzfähigen mikrofluidischen System. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert die Herstellung einer mikrofluidischen Platte für Scherspannungsstudien in bakteriellen Kulturen. Nach dem Primieren der Kanäle mit Medien werden Bakterienzellen in den experimentellen Kanal eingeführt und zur Befestigung inkubiert. Restmedien und Kultur werden entfernt, um das System auf spätere Scherspannungsexperimente vorzubereiten.

Protokoll

1. Medienvorbereitung

1. Bereiten Sie Minimalmedium (MM) mit 0,25 % Glukose vor. Um 1 L MM mit 0,25 % Glukose herzustellen, fügen Sie 200 ml sterile M9-Salzlösung, 2 ml sterile 1 M Magnesiumsulfat (MgSO₄), 100 μL sterile 1 M Calciumchlorid (CaCl₂) und 12,5 ml sterile 20 % (w/v) Glukose in Wasser (dH₂O) mit einem Endvolumen von 1 L hinzu.
2. Das benötigte Medium in eine sterile Flasche mit sterilen Techniken übertragen. Bereite die benötigte Menge je nach Anzahl der verwendeten Kanäle vor. Typischerweise benötigt jeder Kanal 200 μL zum Priming, 300 μL zum Seeding und 1300 μL für das 24-Stunden-Experiment.
3. Stellen Sie die Flasche in einen Inkubator oder ein Wasserbad, das auf die Versuchstemperatur eingestellt ist. Das Medium sollte vor der Verwendung die Experimenttemperatur erreichen, um Blasen in den Mikrokanälen zu vermeiden.

2. Herstellung einer Übernacht- und experimentellen Kultur des Pseudomonas aeruginosa-Stamms PA01, der ein verbessertes grünes fluoreszierendes Protein (PA01-EGFP) exprimiert.

1. Geben Sie 15 ml Versuchsmedium in eine sterile Seitenwaffe und inokulieren Sie mit ein oder zwei Kolonien aus einer Agarplatte, die mit PA01-EGFP gestreift ist. Erweitern Sie die Kultur für 12–16 Stunden auf einem Inkubator/Schüttertisch bei 37 °C und 180–220 U/min.
2. Misse den OD₆₀₀ der Übernachtkultur. Wenn der OD₆₀₀ größer als 0,80 ist, verdünnen Sie die Übernachtkultur mit frischem MM auf einen endgültigen OD von 0,8. Stellen Sie die Versuchskultur in einen Inkubator oder ein Wasserbad bei 37 °C, bis sie für das Aussäen der Mikrofluidikkanäle benötigt wird. Überprüfen Sie den OD₆₀₀ unmittelbar vor dem Seed erneut, um sicherzustellen, dass er sich nicht wesentlich vom Ziel-OD₆₀₀, in diesem Fall 0,8, verändert hat.

3. Gerätestart

1. Richte die Systemstation gemäß der Benutzeranleitung ein, ähnlich wie in Abbildung 1. Um einen Fehler in der Verbindung des Instruments mit der Software zu vermeiden, schalten Sie das Instrument in folgender Reihenfolge ein:
   PC Workstation
   Fluoreszenzmodul. Stelle sicher, dass der Fluoreszenzverschluss AN ist (blaues Licht beim Auslöserknopf an).
   Hardware-Controller
   Bildsystem-Controller (siehe Materialtabelle)
   CCD-Kamera
   Bildgebungsstation (Mikroskop)
   HINWEIS: Die Temperatur der Heizplatte sollte auf die gewünschte Versuchstemperatur eingestellt werden.
2. Starten Sie die Steuerungsanwendung und geben Sie die Kennzeichennummer ein, die sich auf dem Etikett an der Seite des Kennzeichens befindet.
   HINWEIS: Nach Beginn der Steuerungsanwendung gibt es zwei separate Anwendungsfenster, eines für die Software, die die Mikroskop-/Bildbearbeitungssoftware steuert, und eines für das Steuermodul, das die Pumpe und die Well-Plate-Schnittstelle steuert.

4. Grundieren und Aussäen der mikrofluidischen Platte

HINWEIS: Das Primen, die Aussaat, die bakterielle Anhaftung und das Wachstum sind in Abbildung 2 dargestellt.

1. Nehmen Sie die 48-Wellen-Mikrofluidikplatte aus der Verpackung und achten Sie darauf, die Glasoberfläche am Boden der Platte nicht zu berühren. Reinigen Sie den Glasträger am unteren Rand der Platte mit einem Linsentaschentuch, einem fusselfreien Tuch oder einem Flusenarmen Tuch.
2. Um die mikrofluidischen Kanäle zu primieren, pipettieren Sie 200 μL 37 °C MM in den Ausgangsbrunnen und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Setze die Platte in die Plattenstufe und wische die Oberfläche mit Ethanol ab, damit sie trocknet, bevor du sie auf der Plattenstufe versiegelst.
3. Im manuellen Modus am Steuermodul stellen Sie Fluid als
   Luria-Bertani (LB) bei 37 °C und maximale Scherung bei 5,00 dyn/^cm2. Klicken Sie auf die Ausgangswellen, um den Fluss vom Ausgang zum Eingangsschacht zu aktivieren und die Kanäle zu starten. Nach dem 5-minütigen Grundieren wird der Fluss unterbrochen, um die Aussaat vorzubereiten. Entfernen Sie vorsichtig die Platte von der Stufe und pipettieren Sie Restmedien aus dem Ausgang, aber entfernen Sie kein Medium aus dem inneren Kreis, der zu den mikrofluidischen Kanälen führt.
4. Um die experimentellen Kanäle zu säen, wird zunächst 300 μL MM in den Eingangsbrunnen gepipettert und anschließend 300 μL der Bakterienkultur in den Ausgangsbrunnen in den Ausgangsbrunnen gepipettiert. Stellen Sie die Platte zurück in die Plattenstufe und wischen Sie die Schnittstelle, bevor Sie sie auf die Platte legen.
5. Im Kontrollmodul wird nach dem Platzieren der Plattenstufe auf die Mikroskopstufe mit dem Live-Kamerafeed auf einen einzelnen Kanal fokussiert. Während der visuellen Überwachung durch den Live-Feed wird der Fluss mit 1,00–2,00 dyne/cm^² für etwa 2–4 Sekunden wieder aufgenommen, damit die Zellen in den experimentellen Kanal eindringen können, aber nicht in die serpentinischen Kanäle. Lassen Sie die Platte 1 Stunde auf der temperaturkontrollierten Stufe, um die Zellanhaftung zu ermöglichen. Während der 1-Stunden-Inkubation können das Control Module und die Montage-Software für das Autorun eingerichtet werden.
   HINWEIS: Die benötigte Zeit für die Aussaat variiert je nach Medienmedium und Organismus, daher sollte sie bis zur Optimierung genau überwacht und als allgemeiner Zeitrahmen durch das Lebendfutter überwacht werden. Die Aussaat auf der gesamten Platte kann variieren, was mehr Zeit für den Fluss in bestimmte Kanalspalten für die vollständige Aussaat erfordert.
6. Nach der Befestigungsphase wird die Platte vorsichtig von der Bühne entfernt und die Bakterien zuerst vom Ausgang pipettiert, ohne den Kanal zu stören. Mit einer neuen Pipettenspitze entferne das Medium aus den Eingangsöffnungen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Einzelne Komponenten des mikrofluidischen Systems. Die einzelnen Komponenten sind von links nach rechts aufgelistet: 1. CCD-Kamera, 2. Hochauflösendes Invertiertes Mikroskop mit automatischer Bühne, automatischem Fluoreszenzmod...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ammoniumchlorid, ACS	VWR	BDH9208-500G	Teil der minimalen Medienkomposition
BioFlux 1000 48 Bohrlochplatte mit niedriger Scherung	Fluxion-Biowissenschaften	910-0047
BioFlux 1000Z Mikrofluidisches Bildgebungssystem	Fluxion-Biowissenschaften	BF 1000Z
Calciumchloriddihydrid, ACD-Qualität	VWR	97061-904	Teil der minimalen Medienkomposition
Dextrose, wasserfrei, ACS	VWR	BDH9230-500G	Teil der minimalen Medienkomposition
Magnesiumsulfat ACS-Qualität	VWR	EM-MX0070-1	Teil der minimalen Medienkomposition
Kaliumphosphat monobasisch, ACS-Qualität	VWR	BDH9268-500G	Teil der minimalen Medienkomposition
Pseudomonas Aeurginosa GFP	ATCC	15692GFP	Pseudomonas aeurinosa Bakterienstamm PA01 mit GFP-Modifikation wurde für diese Studie verwendet.
Natriumchlorid, ACS	VWR	BDH9286-500G	Teil der minimalen Medienkomposition
Natriumphosphat, monobasisch, wasserfrei, Reagenzqualität	VWR	97061-942	Teil der minimalen Medienkomposition