Bewertung der Rolle der Wirtsimmunität bei mykobakteriellen Infektionen mittels eines Zebrafischmodells

Zusammenfassung

Quelle: Luukinen, H., et al. Modellierung von Tuberkulose bei Mycobacterium marinum-infizierten erwachsenen Zebrafischen. J. Vis. Exp. (2018).

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.

1. Experimentelle M. marinum-Infektion mit intraperitonealer Injektion

1. Pipettieren Sie einen 5-μL-Tropfen der verdünnten bakteriellen Lösung auf ein Stück Parafilmfilm und ziehen Sie den Tropfen in eine 30-G-Insulinnadel.
2. Verwenden Sie 5–8 Monate alte Wildtypfische und rag1−/−hu1999 mutierte Fische für das Experiment. Betäuben erwachsene Zebrafische im Beckenwasser mit 0,02 % 3-Aminobenzoesäure-Ethylester (pH 7,0). Positioniere den Fisch mit der Bauchseite nach oben in einen Schlitz auf feuchtem, geschäumtem Plastik.
   HINWEIS: Rag-/-mutierte Fische können keine somatische Rekombination durchlaufen und keine funktionellen T- und B-Zellen produzieren.
3. Injizieren Sie die Nadel zwischen die Bauchflossen in einem Winkel von etwa 45°. Halte die Nadel nach oben geöffnet, um zu beobachten, dass die gesamte Öffnung im Bauchraum liegt. Langsam die bakterielle Suspension injizieren und die Nadel vorsichtig entfernen.
   HINWEIS: Falls der rote Tracer beim Eintreten aus dem Fisch austritt, schließen Sie den Fisch aus dem Experiment aus.
4. Unmittelbar nach der Injektion werden die Fische in ein Aufholbecken mit frischem Beckenwasser überführt.
5. Entnehmen Sie alle 15 Minuten Proben der bakteriellen Suspension auf 7H10-Platten vom verwendeten bakteriellen Aliquot und inkubieren Sie die Bakterien bei 29 °C für 5 Tage und überprüfen Sie die Infektionsdosis, indem Sie die Kolonien auf den Platten zählen.
6. Überprüfen Sie regelmäßig das Wohlbefinden der Fische und lassen Sie alle Fische mit Symptomen einer Infektion mit einer Konzentration von über 0,02 % von 3-Aminobenzoesäure-Ethylester (pH 7,0) einschläfern.
   HINWEIS: Ungefähr 7 % der erwachsenen Zebrafische, die mit 34 ± 15 CFU infiziert sind, und 30 % der mit 2029 ± 709 CFU infizierten Zebrafische, werden bis 8 Wochen Symptome haben. Zu den Symptomen können abnormales Schwimmen, mangelnde Reaktion auf Berührung, Keuchen, Ödeme oder beobachtbare Auswaschung gehören.
7. Pflege der Zebrafische nach den gängigen Standards

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mycobacterium marinum	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 927
Middlebrock 7H10 Agar	BD, Thermo Fisher Scientific	11799042
Middlebrock OADC-Anreicherung	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Middlebrock 7H9 Medium	BD, Thermo Fisher Scientific	11753473
Middlebrock ADC-Anreicherung	BD, Thermo Fisher Scientific	11718173
Phosphatgepufferte Kochsalzlösungstabletten (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-50TAB
Phenolrot	Sigma-Aldrich	P3532
27-G-Nadel	Henke Sass Wolf	4710004020
1-mL-Spritze	Henke Sass Wolf	4010.200V0
Omnican 100 30 G Insulinnadel	Braun	9151133
3-Aminobenzoesäure-Ethylester (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	A5040