In-vitro-Parallelplatten-Flussmodell zur Untersuchung der bakteriellen Adhäsion an einer Gewebebiopsie

Zusammenfassung

Quelle: Ditkowski, B., et al. Ein in-vitro-Modell eines Parallelplatten-Perfusionssystems zur Untersuchung der bakteriellen Haftung an Transplantatgeweben. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert die Methode, eine Parallelplatten-Flusskammer zu verwenden, um fluoreszenzmarkierte Bakterien über vaskuläres Transplantatgewebe zu perfundieren, was eine kontrollierte Analyse der bakteriellen Adhäsion und der frühen Pathogenese unter Scherflussbedingungen ermöglicht.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tierproben betreffen, wurden vom zuständigen ethischen Ausschuss für Tiere überprüft und genehmigt.1. In-vitro-Perfusionsexperimente mit einer Parallelplatten-Strömungskammer

1. Bringen Sie Gewebebiopsien mit 10 mm Durchmesser und gleicher Dicke in ein Strömungskammersystem, wobei die Innenfläche nach oben zeigt, um mit der bakteriellen Suspension in Kontakt zu kommen.
   HINWEIS: Die gleiche Gewebedicke über verschiedene Transplantate sorgt dafür, dass im Kanal die gleiche Gewebehochkeit erreicht wird, was laminaren Fluss unter allen Bedingungen ermöglicht. Alle Elemente der Strömungskammer sind in Abbildung 1 dargestellt und beschrieben.
   1. Um das Protokoll zu beginnen, wird das runde Gewebestück zwischen einen Mikroskop-Objektträger mit einer 8-mm-Rundperforation und eine Gummidichtung gesetzt.
      HINWEIS: Der Mikroskopträger besitzt die ultradünne Unterschicht, die die Erzeugung des 8-mm-Lochs ermöglicht. Zusammen mit der Gummifolie fixiert er das Gewebe, um den direkten Kontakt zwischen der Probe und dem fließenden Medium zu ermöglichen, und verhindert außerdem die Verrenkung der Biopsie während des Experiments. Die Oberfläche des untersuchten Gewebes, die der Strömung ausgesetzt ist (kleinerer Durchmesser), kann mit der Pinzette nicht manipuliert werden.
      1. Führen Sie den Halter mit dem Gewebe in das Dichtungsblatt, das im unteren Metallrahmen der Kammer eingebettet ist.
      2. Befestigen Sie den oberen Metallrahmen mit der entsprechenden Dichtungsplatte am unteren Teil der Kammer mit dem zuvor eingesetzten Gewebehalter. Anschließend befestigen Sie die gesamte Kammer mit acht Schrauben und Schraubmuttern. Stellen Sie sicher, dass die Höhe der Kammer bei allen Transplantaten immer gleich ist.
         HINWEIS: Die Höhe der Kammer sollte immer beim Anziehen der Schrauben bestimmt werden. Benutze einen Bremssattel oder Lineal.
2. Verbinden Sie die Durchflusskammer mit einer Peristaltik und das Flüssigkeitsreservoir mit den Schläuchen.
3. Perfundieren Sie das Gewebe mit Suspensionen von 10 à⁷ CFU/mL (verifiziert durch CFU-Zählung (Colony-forming unit counting und im Zusammenhang mit OD₆₀₀ (optische Dichte) Messungen) fluoreszenzmarkierten Bakterien in PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) mit einer Scherspannung von 3 dyn/cm^² (dyne pro Quadratzentimeter Druckeinheit) mittels der Peristaltikpumpe (Durchflussrate 4 mL/min) für 1 Stunde unter Verwendung eines 400 mL Bakterienreservoirs (hauseigene Konstruktion, Abbildung 1) bei 37 °C mit einem Plattenthermostat (Materialtabelle) konditioniert.
4. Zirkulieren Sie kontinuierlich die 100 ml bakterielle Suspension mit demselben Sammelreservoir.
5. Nach der Perfusion wird die Kammer zerlegt, um das Transplantat freizusetzen, und das Gewebestück zweimal mit 4 ml PBS in einer 12-Well-Platte mit dem Labororbitalshaker jeweils 3 Minuten gewaschen. Anschließend wird der innere Teil des Transplantats mit einer Hautbiopsie-Punch mit kleinerem Durchmesser abgeschnitten.
6. Jede Gewebebiopsie wird in ein separates 14-ml-Rohr mit 1 ml steriler 0,9 % NaCl gelegt. Beschrifte die Röhre als #1.
7. Lösen Sie die Bakterien vom Gewebe mit einem Sonikationsbad für 10 Minuten (Amplitude = 100 % und Frequenz = 45 kHz).
   HINWEIS: Die vollständige Ablösung der Bakterien aus den Gewebetransplantaten sollte nach der Inkubation der Patches über Nacht bei 37 °C in TSB (Tryptic Soy Brüh) flüssigem Medium bewertet werden, gefolgt von_{OD-600-Messungen} im Vergleich zu Kontrollpatches, die mit bakterienfreier Lösung behandelt wurden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Bild eines neu entwickelten Durchflusskammersystems (hauseigenes Design). A. Die Strömungskammer (1) montierte Durchflussmenge mit den Maßen LxWxH: 125 mm x 55 mm x 18 mm (Schrauben in Kombination mit Schraubmuttern halten die ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rinder-Perikard-(BP)-Patch, Supple Peri-Guard Pericardium	Synovis Surgical Innovations, USA	PC-0404SN
Rinder-Jugularvenen-Leitungen (BJV)	Contegra-Leitung; Medtronic Inc, USA	M333105D001
CH kryokonserviertes Homograft	Europäische Homograftbank (EHB)	-
Acu-Punch	Acuderm Inc, USA	P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
Menschliches Albumin	Flexbumin; Baxter, Belgien	BE171464LOT:16G12C
Tryptische Sojabrühe (TSB)	Fluka, Steinheim, Deutschland	22092-500G
Herzinfusionsbrühe (BHI)	Fluka	53286-500G
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).	Gibco	14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-Hydroxysuccinimidester (CF)	Sigma-Aldrich, Deutschland	21878-100MG-F
Peristaltische Pumpe (MODELL ISM444B)	Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Deutschland	631942-2
Sonikationsbad	VWR Ultraschallreiniger; VWR, Radnor, Pa	142-6044	230V/50-60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen von ThermoFisher	P36930
Arium Pro VF – ultrareines Wasser – H2O MilliQ	Millipore	87206462
Mikroskopische Objektträger – Gewebekulturkammern (1-Brunnen)	Sarstedt	94.6140.102
1-Brunnen auf Lumox abnehmbaren	Sarstedt	94.6150.101
Edelstahl – chirurgische Klingen	Swann-Morton	311
Tygon Silikonschlauch, 1/8" Innendurchmesser x 1/4" Überdurchmesser	Cole-Parmer	EW-95702-06	Temperaturbereich: –80 bis 200°CSterilisieren: Mit Ethylenoxid, Gammabestrahlung oder Autoklaven für 30 Minuten, 15 psi Druck
PharMed BPT-Schläuche	Saint-Gobain	AY242012	Autoklavierbar 30 Minuten bei 121°C
Tygon LMT-55 Rohr	Saint Gobain Performance Plastics™	15312022
Thermostat	BMG BIOMEDIZINTECHNIK	300-0042	230V, 90VA, 50Hz