Reinigung der viralen Integrase mittels Affinitätschromatographie

Zusammenfassung

Quelle: Lopez Jr., M. A., et al. Nachweis und Entfernung von Nuklease-Kontaminationen während der Reinigung rekombinanter Integrase des Prototyp-Foamy-Virus. J. Vis. Exp. (2017)

In diesem Video wird die Reinigung eines polyhistidinmarkierten viralen Integrase mittels Nickelaffinitätschromatographie demonstriert. Das Protokoll verwendet eine Imidazol-Gradientenelution, um das Integrase basierend auf seiner Affinität zum nickelbeladenen Harz gezielt zu isolieren.

Protokoll

1. Nickelaffinitätschromatographie

1. Tauen Sie ein bakterielles Pellet auf Eis auf.
   HINWEIS: Dies dauert erhebliche Zeit (ca. 2–3 h). Sobald das Pellet zu einer Zellsuspension aufgetaut ist, zugeben eines zusätzlichen 500 μM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) (100 mM Stammlösung).
2. Halten Sie den 50-mL-Zylinder mit der Bakteriensuspension auf Eis. Sonifizieren Sie die Bakterien mit 30 % Amplitude für 30 s (1 s an, 1 s aus) pro Pellet aus 1 L Kultur, unter Verwendung eines Ultraschallgeräts mit einem Bio-Horn mit 0,5 Zoll Durchmesser und einem konisch zulaufenden Mikrotip mit 0,125 Zoll Durchmesser, einer Frequenz von 20 kHz und einer maximalen Leistung von 400 W.
3. Überführen Sie die Zellprobe in ein kaltes Ultrazentrifugenröhrchen. Verwenden Sie Polycarbonat-Flaschenaufsätze (25 mm Durchmesser, 89 mm Höhe), die mit einem festen Winkelrotor vom Typ 60 Ti kompatibel sind. Alternativen Röhrchen und Rotoren können verwendet werden, sofern die gleiche Gravitationskraft erreicht wird. Zentrifugieren Sie 60 min bei 120.000 x g bei 4 °CEs sollte sich ein deutliches Pellet absetzen. Das Überstand kann eine gelbe Farbe aufweisen.
4. Überführen Sie das Überstand mittels Gießen oder Pipettieren in einen kalten 50-mL-Kegelrohr. Notieren Sie das Volumen; dieses sollte ungefähr dem Volumen des vor dem Schnellgefrieren verwendeten Resuspendierpuffers entsprechen. Falls der Überstand viskos ist, könnte er mit bakterieller DNA kontaminiert sein, die die Chromatographiesäule verstopfen könnte. In diesem Fall wiederholen Sie die Ultrazentrifugation, um die bakterielle DNA zu pelletieren.
5. 500 mL Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) und 500 mL Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM Imidazol).
   HINWEIS: In diesem Protokoll müssen das Fast-Protein-Liquid-Chromatographie-(FPLC-)System, alle Puffer und die Probe bei 4 °C im Kühllabor
   1. Sterilfiltrieren Sie die Puffer A und B mit 0.2 μm Einweg-Filtereinheiten. Abhängig vom FPLC-System pump A und pump B jeweils mit Puffer A und Puffer B spülen. 90 % Puffer A und 10 % Puffer B durch das System leiten, bis die Leitfähigkeits- und Ultraviolett-(UV)-Messwerte stabil sind. Die maximale Flussrate hängt vom Instrument ab; verwenden Sie eine Flussrate von 5 mL/min bei einer maximalen Druckbegrenzung von 1,0 MPa.
6. Stellen Sie eine 110 mm lange, 5 mm durchmessende FPLC-Säule mit 1,5 mL nickelbeladener Harzphase (maximale Bindungskapazität 50 mg/mL, maximale Druckbelastung 1 MPa) her. Die Säule kann am Tag vor der Reinigung vorbereitet und bei 4 °C gelagert werden. ˚C.
7. Verbinden Sie die Säule mit dem FPLC-Gerät. Äquilibrieren Sie die Säule mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B (20 mM Imidazol) bei einer Flussrate von 0,5 mL/min und einer maximalen Druckbegrenzung von 0,5 MPa. Das Gerät sollte Echtzeitdaten der Leitfähigkeit und der UV-Absorption bei 280 nm (A₂₈₀Die Leitfähigkeit und die UV-Absorptionswerte sollten sich stabilisieren. Falls diese Werte noch nicht stabil sind, sollte der Puffer weiterhin durch die Säule geleitet werden, bis Stabilität erreicht ist.
8. Laden Sie die Proteinstichprobe (~10 mL pro Pellet) mit einer Flussrate von 0,15 mL/min und einer maximalen Druckbegrenzung von 0,5 MPa auf die Säule. Die Flussrate und der Säulendruck bleiben während der gesamten Reinigung konstant. Sammeln Sie den Durchlauf in einem 50-mL-Röhrchen.
   1. Spülen Sie die Säule mit 20 mL 90 % Puffer A und 10 % Puffer B. Sammeln Sie die Waschfraktion in einem 50-mL-Röhrchen. Eluieren Sie die Proteine mit einem 20-mL-linearen Gradienten von 10 % auf 100 % Puffer B (20 mM bis 200 mM Imidazol).
   2. Schließlich spülen Sie die Säule mit 5 mL 100 % Puffer B (200 mM Imidazol). Sammeln Sie den Gradienten und die endgültige Waschung in Fraktionen von jeweils 0,27 mL.
9. Kombinieren 15 μL von 2x SDS-PAGE-Probenpuffer mit 15 μL des Durchlaufs, der Waschfraktion und der Peak-Fraktion bei A₂₈₀ Proben. Die Proben 3 min lang kochen.
   1. Bereiten Sie zwei 10%-SDS-PAGE-Gele vor. Beladen Sie 10 μL jeweils 10 μL jeder Probe auf die Gele 4 μL von vorgefärbten Proteinstandards. Die Gele laufen, anfärben und analysieren.
   2. Kombinieren Sie Fraktionen, die nach visueller Inspektion nahezu reines Integrase des prototypischen Foamyvirus (PFV IN) enthalten. Messen Sie das Volumen mittels Pipettierung, typischerweise 8–10 mL.
   3. Messen Sie mithilfe eines Spektrophotometers die A₂₈₀ der kombinierten Fraktionen und berechnen Sie die Gesamtmenge des PFV-IN-Proteins; die typische Ausbeute beträgt etwa 10 mg pro Liter induzierter Kultur. Der Extinktionskoeffizient von PFV IN mit dem Hexahistidin-Tag beträgt 59360 cm⁻¹ M⁻¹.^-1 M^-1.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
Imidazol	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430