Evaluierung der Hemmung der Virusausbreitung durch microRNA-Mimic-vermitteltes Genomsilencing

Zusammenfassung

Quelle: Ruiz, A. J. und Russell, S. J. Mikro-RNA-vermittelte Regulation der Picornavirus-Tropismus. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Verwendung synthetischer microRNA-Mimics zur selektiven Hemmung der viralen Replikation in kultivierten epithelartigen Zellen. Es zeigt, wie die durch microRNAs gesteuerte Genom-Silenzierung die Virusausbreitung blockieren und die Targeting-Spezifität durch nachgeschaltete Infektiositätsanalysen bestätigen kann.

Protokoll

1. Bewertung der microRNA-Ziel-Spezifität: Virusausbreitungs-Assay unter Verwendung synthetischer microRNA-Mimics

HINWEIS: Der Einsatz eines synthetischen microRNA-Mimetikums dient dazu, die Spezifität der Wechselwirkung zwischen microRNA und microRNA-Ziel zu demonstrieren.

1. Führen Sie für jeden Assay Kontrollen mit Mock-Transfektion, negativem Kontroll-microRNA-Mimetikum und ausschließlich experimentellem microRNA-Mimetikum durch, um die microRNA-vermittelte Toxizität zu bewerten. Es ist außerdem empfehlenswert, eine positive Kontrolle (d. h. ein microRNA-zielgerichtetes Gen oder Genom) einzuschließen, da eine geringe Transfektionseffizienz der microRNA-Mimetika zu falsch-negativen Ergebnissen führen kann.
2. Plattieren Sie H1-HeLa-Zellen in einer 96-Well-Zellkulturplatte, sodass sie zum Zeitpunkt der Transfektion (24 h nach der Aussaat) 80–90 % konfluent sind. Plattieren Sie die Zellen in DMEM (Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium), ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, mit je 0,1 mL pro Vertiefung.
   HINWEIS: Führen Sie diesen Assay in Zellen durch, die für die Virusreplikation permisiv sind und die entsprechenden microRNAs nicht exprimieren.
3. Erwärmen Sie die Transfektionsreagenzien auf Raumtemperatur. Geben Sie 9 µL serumfreies Medium, microRNA-Mimetikum-Stammlösung mit einer Endkonzentration von 200 nM pro Vertiefung, 0,18 µL Boost-Reagenz und 0,18 µL Transfektionsreagenz zusammen und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie die Mischung 2–5 min bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Die angegebenen Volumina beziehen sich auf jede Vertiefung. Es wird empfohlen, eine Master-Mischung für die Transfektion aller Vertiefungen herzustellen, um Konsistenz zu gewährleisten und Pipettierfehler zu minimieren. Die optimale Konzentration des microRNA-Mimetikums kann variieren. Konsultieren Sie die Herstelleranleitung des microRNA-Mimetikums, um eine geeignete Startkonzentration zu ermitteln. Diese liegt in der Regel zwischen 5 und 200 nM Endkonzentration.
4. Aspirieren Sie das Medium aus den Vertiefungen und geben Sie 92 µL frisches, vollständiges Medium hinzu.
   HINWEIS: Wenn eine größere Anzahl von Proben vorliegt, führen Sie diesen Schritt vor der Herstellung der Transfektionslösung durch und lagern Sie die Platte bis zur weiteren Verwendung bei 37 °C.
5. Geben Sie die gesamte Transfektionsmischung tropfenweise zu den Zellen hinzu.
6. Inkubieren Sie 6 h bei 37 °C.
7. Infizieren Sie jede Vertiefung mit einem niedrigen MOI (Multiplizität der Infektion), um sicherzustellen, dass nur ein geringer Prozentsatz der Zellen infiziert wird, was die Analyse der Virusausbreitung ermöglicht. Dieses Protokoll verwendet einen MOI von 0,2.
   1. Verdünnen Sie die Virusstämme in serumfreiem Medium auf eine Konzentration von MOI = 0,2 pro 100 µL. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und geben Sie je 100 µL Virusverdünnung pro Vertiefung hinzu.
   2. Inkubieren Sie 2 h bei 37 °C.
8. Aspirieren Sie das Medium aus jeder Vertiefung und geben Sie 100 µL frisches, vollständiges Medium hinzu.
9. Inkubieren Sie 20–22 h bei 37 °C.
10. Bestimmen Sie die Virus-Titrierung in den Überständen.
    1. Sammeln Sie den Überstand aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie ihn durch 100 µL frisches, vollständiges Medium.
       HINWEIS: Wenn Suspensionzellen verwendet werden, resuspendieren Sie das Zellpellet aus dem folgenden Schritt in 100 µL frischem, vollständigem Medium und geben Sie es in die entsprechende Probevertiefung für den Vitalitätsassay zurück.
    2. Entfernen Sie zelluläre Trümmer aus den gesammelten Überständen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 °C.
    3. Überführen Sie den geklärten Überstand in ein frisches Röhrchen und titrieren Sie infektiöses Virus auf permissiven Zellen, die die entsprechenden microRNAs nicht exprimieren. 
       HINWEIS: Halten Sie alle Proben auf Eis, um den Verlust der Infektiosität zu verhindern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nukleasefreies Wasser	Fisher Scientific	AM9938
TransIT-2020-Transfektionsreagenz	Mirus	MIR 5404
TransIT-mRNA-Transfektionsreagenz	Mirus	MIR 2225
2-mL-Schraubverschlussröhrchen	Sarstedt	72.694.005
MicroRNA-Mimics	Dharmacon	Varied
MTT-Zellproliferationsassay	ATCC	30-1010K