Erzeugung eines rekombinanten Masernvirus, das ein immunostimulatorisches Protein kodiert

Zusammenfassung

Quelle: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviren für die tumorspezifische Immunmodulation: Design und Evaluierung ex vivo. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video wird die Herstellung rekombinanter Masernviren demonstriert, bei der Liposomen verwendet werden, um Plasmide, die das virale Antigenom und essentielle Hilfsproteine kodieren, in Produzentenzellen einzubringen. Die transkribierte und replizierte RNA führt zur Bildung von Viruspartikeln, die immunstimulierende und fluoreszierende Reportergene exprimieren. Anschließend wird die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um die Bildung von Syncytien sichtbar zu machen und somit die erfolgreiche Herstellung rekombinanter Viren zu bestätigen.

Protokoll

HINWEIS: [O], [P] und [M] kennzeichnen Unterabschnitte, die jeweils für: onkolytische Viren (OVs) im Allgemeinen, (die meisten) Paramyxoviren oder nur für das Masernvirus (MV) gelten. [B] kennzeichnet Abschnitte, die spezifisch für bispezifische T-Zell-Aktivator-(BTE-)Transgene sind.

1 Klonierung von Immunmodulator-codierenden Transgenen in Masernvirus-Vektoren

1. [O] Gestalten Sie die Sequenz des Inserts.
   1. [O] Wählen Sie basierend auf Literaturrecherche oder explorativen Daten wie Genomweiten Screens einen interessierenden Immunmodulator aus und leiten Sie die entsprechende komplementäre DNA (cDNA)-Sequenz aus geeigneten Datenbanken wie GenBank, dem European Nucleotide Archive oder dem internationalen ImMunoGeneTics information system (IMGT) ab.
   2. [O] Ergänzen Sie zusätzliche Elemente in die Transgen-Sequenz (Abbildung 1). Eine vorangestellte Kozak-Sequenz und artenspezifische Codon-Optimierung können die Expression verbessern. Signalsequenzen sind für die Sekretion erforderlich. Fügen Sie Sequenzen ein, die N- und/oder C-terminale Protein-Tags für Nachweis und Reinigung kodieren. Fügen Sie Restriktionsstellen für die Einfügung in den Vektor ein.
      HINWEIS: [M] Zusätzliche Transkriptionseinheiten (ATUs), die Start- und Stoppsignale des MV-Polymerasegens enthalten, sind notwendig, um die Expression des Transgens aus rekombinanten MV-Genomen zu ermöglichen. Geeignete antigénomische cDNA-Vektoren, die durch Cytomegalie-Virus-(CMV-)Promotoren kontrolliert werden und ATUs mit eindeutigen Restriktionsstellen für die Einfügung von Transgenen in positiver Orientierung an definierten Positionen enthalten, wurden bereits früher entwickelt. [P] Eine geeignete Positionierung des Transgens ist entscheidend, da sie aufgrund des für Paramyxoviren typischen Expressionsgradienten die virale Replikation und die Transgen-Expression beeinflusst. Die Einfügung in eine ATU nahe dem 3'-Ende des Antigenoms (z. B. in Leader-Position oder stromabwärts des P-Gens) führt in der Regel zu einer hohen Transgen-Expression auf Kosten einer verminderten viralen Replikation. Eine höhere Replikation bei gleichzeitig geringerer Transgen-Expression ist zu erwarten, wenn die ATU stromabwärts des H-Gens verwendet wird. Die Verpackung des Genoms mehrerer Paramyxoviren, einschließlich des Masernvirus, erfordert, dass jedes Nukleokapsidprotein sechs Nukleotide bindet. Um Transgene in solche Viren einzufügen, stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Nukleotide des kompletten Genoms durch sechs teilbar ist. Dies wird auch als „Sechser-Regel“ bezeichnet. Falls erforderlich, fügen Sie zusätzliche Nukleotide in das Insert ein (stromaufwärts der Kozak-Sequenz oder stromabwärts des Stoppcodons), ohne Leseraster-Verschiebungen oder vorzeitige Stoppcodons zu erzeugen. [M] Vermeiden Sie bestimmte Sequenzen im Transgen, die den MV-Genstartsignalen (AGGRNCMARGW) und Stoppsignalen (RTTAWANAAAA) sowie RNA-Editiersequenzen (AAAAAGGG) ähneln.
   3. [O] Beziehen Sie Oligonukleotide der gewünschten Sequenz oder setzen Sie diese aus verfügbaren Sequenzen mittels Standardverfahren der molekularen Klonierung zusammen.
      HINWEIS: [O] Entwerfen Sie für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Verstärkung des Transgens einen Vorwärtsprimer, der die stromaufwärts gelegene Restriktionsstelle und die ersten 15–20 Nukleotide des Inserts enthält, sowie einen Rückwärtsprimer, der die letzten 15–20 Nukleotide des Inserts gefolgt von der stromabwärts gelegenen Restriktionsstelle enthält.
2. [O] Klonen Sie das Insert in die DNA, die das virale (Anti-)Genom kodiert.
   1. [O] Klonen Sie das Insert mittels Standardverfahren der molekularen Klonierung (z. B. enzymatische Restriktion gefolgt von DNA-Ligation) in DNA-Vektoren oder DNA-Antigenome von RNA-Viren ein.
      1. [O] Verhindern Sie die Re-Ligation des Vektors, indem Sie inkompatible Restriktionsstellen verwenden oder den Vektor vor der Ligation dephosphorylieren.
      2. [O] Isolieren Sie das Ligationsprodukt durch Agarose-Gelelektrophorese und anschließende Gelextraktion unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits. Im Allgemeinen wird eine optimale Ligations-Effizienz bei einem molaren Verhältnis von 3:1 (Insert zu Vektor) erreicht.
   2. [O] Transformieren Sie das Ligationsprodukt in kompetente Bakterien, die für die effiziente Gewinnung großer Plasmide geeignet sind (z. B. durch Hitzeschock von E. coli), und identifizieren Sie bakterielle Klone, die die korrekte DNA enthalten, mittels Kolonie-PCR.
   3. [O] Isolieren Sie amplifizierte DNA aus einem einzelnen bakteriellen Klon unter Verwendung kommerziell erhältlicher DNA-Präparationskits. Bestätigen Sie die genomische Integrität durch Kontrollverdau mit geeigneten Restriktionsenzymen (z. B. HindIII für MV-Genome [M]). Bestätigen Sie die korrekte Einfügung und Integrität des Transgens durch Sequenzierung.
      HINWEIS: [M] Führen Sie bei Transgenen, die in die MV-H-ATU eingefügt wurden, eine Sanger-Sequenzierung mit folgenden Primern durch: H-9018 [Vorwärtsprimer, bindet an die MV-Genomposition 9018 im H-Open-Reading-Frame (ORF)]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249+ (Rückwärtsprimer, bindet an die MV-Genomposition 9249 im L-ORF): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. Gewinnung rekombinanter Masernviruspartikel, die Immunmodulatoren kodieren

1. [O] Erzeugen Sie rekombinante Viruspartikel aus (Anti-)genomischer DNA durch Transfektion von Virusproduzentenzellen gemäß dem Standardprotokoll für das jeweilige Virus. Befolgen Sie die Richtlinien für die Arbeit unter sterilen Bedingungen. Führen Sie die Zellkultur in Hauben durch, insbesondere alle Schritte mit Virus im Sicherheitswerkbank der Klasse II.
   1. [M] Zum Rekanalisieren von Masernviren aus cDNA säen Sie MV-Produzenten-(aus afrikanischen Grünaffen-Nieren abgeleitete Vero-)Zellen 24 h vor der Transfektion gleichmäßig in eine 6-Loch-Platte aus. Säen Sie 2 x 10⁵ Zellen in 2 mL Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) pro Loch, um zum Zeitpunkt der Transfektion eine Konfluenz von 65–75 % zu erreichen.
      HINWEIS: [P] Verringern Sie die Zellanzahl, wenn die Zellen vor der virusinduzierten Synzytienbildung überwachsen.
   2. [P] Transfizieren Sie die Zellen mit DNA, die das virale Antigenom kodiert, erforderlichen Hilfsplasmiden und gegebenenfalls einem Plasmid, das ein fluoreszierendes Reportergen kodiert, um die Transfektionseffizienz zu bewerten.
      1. [M] Mischen Sie 5 µg rekombinante DNA, die das Masernvirus-Antigenom kodiert, jeweils 500 ng Säugerexpressionsplasmide, die die Masernvirus-N- und L-Proteine kodieren, sowie jeweils 100 ng Plasmide, die das P-Protein kodieren, in einem Gesamtvolumen von 200 µL DMEM. Falls gewünscht (und sofern nicht bereits im Antigenom-Konstrukt enthalten), fügen Sie 100 ng eines fluoreszierenden Reportergen-Plasmids hinzu.
      2. Geben Sie 18,6 µL liposomalen Transfektionsreagenz hinzu, mischen Sie sofort durch leichtes Schütteln des Röhrchens und inkubieren Sie 25 min bei Raumtemperatur (RT).
      3. [P] Ersetzen Sie das Medium durch 1,8 mL DMEM mit 2 % FBS und 50 µg/mL Kanamycin (oder einem anderen Antibiotikum zur Verhinderung von Kontaminationen) pro Loch, geben Sie dann die Transfektionsmischung tropfenweise hinzu und schwenken Sie vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch 2 mL frisches DMEM mit 2 % FBS und 50 µg/mL Kanamycin; wiederholen Sie dies, sobald das Medium sauer wird.
         ACHTUNG: [O] Handhaben Sie Zellen und Materialien gemäß den Biosicherheitsvorschriften, da ab der Transfektion und in den folgenden Schritten Virus vorhanden sein kann. Entsorgen Sie (möglicherweise) infektiöses Abfallmaterial entsprechend.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Genoms eines Masernvirus. Ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) ist in einer zusätzlichen Transkriptionseinheit stromabwärts der Leader-(ld-)Sequenz kodiert. N, P, M, F, H und L bezeichnen Gene, die für die strukturellen Proteine des Masernvirus – Nukleoprotein, P-Protein, Matrixprotein, Fusionsprotein, Hämagglutinin-Protein bzw. großes Protein (Polymerase) – kodieren und wie oben dargestellt unterschiedlich exprimiert werden. Ein biklonaler T-Zell-Engager (BTE) als Transgen wird in eine zusätzliche Transkriptionseinheit (ATU) stromabwärts des H-Open-Reading-Frames eingefügt. Das Transgen kodiert ein Immunglobulin-kappa-(Igκ-)Leaderpeptid für eine effiziente Sekretion sowie Influenza-Hämagglutinin-(HA-) und Hexa-Histidin-(His-)Proteintags zur Detektion und Reinigung. Gene, die für die variablen schweren (VH) und variablen leichten (VL) Ketten-Domänen von Antikörpern kodieren, die gezielt gegen CD3 und CD20 gerichtet sind, sind über Peptid-Linkersequenzen verbunden, die Glycin-(G-) und Serin-(S-)Reste enthalten. Der Transgensequenz geht eine Kozak-Sequenz voraus. Stromabwärts des kodierenden Bereichs wurden zusätzliche Nukleotide beispielhaft eingefügt, um der Sechs-Regel zu genügen. Die Insertionskassette ist von zwei Restriktionsstellen flankiert, die eine Einfügung in die entsprechende ATU ermöglichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Schnelles DNA-Dephos- und Ligationssystem	Roche Life Science, Mannheim, Deutschland	4898117001
CloneJET PCR-Klonierungs-Kit	Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot	K1231
Agarose	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland	A9539-500G
QIAquick Gel-Extraktions-Kit	QIAGEN, Hilden, Deutschland	28704
NEB 10-beta kompetente E. coli	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Deutschland	C3019I
QIAquick Miniprep-Kit	QIAGEN, Hilden, Deutschland	27104
Restriktionsenzym HindIII-HF	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Deutschland	R3104S
Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Deutschland	31966-021
Fötales Rinderserum (FBS)	Biosera, Boussens, Frankreich	FB-1280/500
FugeneHD	Promega, Mannheim, Deutschland	E2311	kann durch ein alternatives Transfektionsreagenz ersetzt werden
Kanamycin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland	K0129
Vero-Zellen	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81
6-Loch-Platten	Neolab, Heidelberg, Deutschland	353046