Herstellung und Ernte von therapeutischen virusproduzierenden Epithelzellen

Zusammenfassung

Quelle: Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxoviren für die tumorspezifische Immunmodulation: Design und Evaluierung ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt den Prozess der Infektion von Nierentubulusepithelzellen mit genetisch veränderten Viren zu deren Herstellung und Gewinnung, um die virale Replikation zu untersuchen.

Protokoll

1. Bestimmung der replikativen und zytotoxischen Kapazitäten viraler Vektoren, die Immunmodulatoren kodieren

Vergleichen Sie die Replikationskinetik des generierten rekombinanten Virus und des unmodifizierten Vektors mithilfe von Ein-Schritt- oder Mehr-Schritt-Wachstumskurven (GCs). Bei Ein-Schritt-GCs wird die Virusnachkommenschaft nach simultaner Infektion aller Zellen (theoretisch 100 % Infektion) bewertet. Mehr-Schritt-GCs beginnen mit einem geringen Prozentsatz infizierter Zellen, um mehrere Runden der Virusreplikation zu verfolgen.

1. Für die Analyse der Replikationskinetik des Masernvirus säen Sie 1 x 10⁵ Vero-Zellen pro Vertiefung in 1 mL DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium) mit 10 % FBS (fötales Rinderserum) pro Vertiefung in 12-Loch-Platten einen Tag vor der Infektion aus. Befüllen Sie für jeden interessierenden Zeitpunkt mindestens zwei Vertiefungen als technische Replikate.
2. Infizieren Sie die Zellen mit dem Virus bei niedriger MOI (Multiplizität der Infektion) für mehrstufige oder bei hoher MOI für einteilige GCs (0,03 bzw. 3 für MV oder Masernvirus) auf Vero-Zellen. Ersetzen Sie das Medium durch 300 µL serumfreies Medium, das die jeweilige Menge des Virus enthält, und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO₂ für mindestens 2 h. Entfernen Sie das Inokulum, geben Sie 1 mL DMEM mit 10 % FBS hinzu und setzen Sie die Inkubation fort.
3. Zu relevanten Zeitpunkten wie 12, 24, 36, 48, 72 und 96 h nach der Infektion gewinnen Sie die virusmäßigen Nachkommen, indem Sie die Zellen direkt in das Medium abkratzen. Überführen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in ein separates Röhrchen, schockgefrieren Sie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie bei -80 °C bis zur Titrierung.
   HINWEIS: Replikatproben können an diesem Schritt zur Analyse der durchschnittlichen Titer vereinigt werden.
4. Sammeln Sie Proben aus allen Zeitpunkten. Tauchen Sie sie gleichzeitig bei 37 °C auf, um die virusmäßigen Nachkommen zu bestimmen. Vortexen und pelletieren Sie Zelltrümmer durch Zentrifugation für 5 min bei 2.500 x g und 4 °C.
5. Berechnen Sie die durchschnittlichen Titer jedes Konstrukts und jedes Zeitpunkts wie oben beschrieben. Tragen Sie die Titer über der Zeit auf. Vergleichen Sie Wachstumskurven von Vektoren mit und ohne eingefügte Transgene, mit unterschiedlichen Transgenen oder mit Transgenen, die an verschiedenen Positionen eingefügt wurden (siehe Abbildung 1).

Ergebnisse

Abbildung 1: Replikationskinetik und lytische Aktivität rekombinanter Masernviren. (A) Einstufige Wachstumskurven wurden nach Infektion von Vero-Zellen mit dem nicht modifizierten onkolytischen Masernvirus (MV) oder dem Masernvirus, das einen bispezifischen T-Zell-Engager kodiert (MV-H-mCD3xhCD20), bei einem MOI von 1 erstellt. Die Titer der viralen Nachkommen wurden zu definierten Zeitpunkten nach der Infektion bestimmt, was auf ähnliche Replikationskinetiken der Viren hindeutet. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von acht Proben (jeweils vier technische Replikate aus zwei biologischen Replikaten pro Zeitpunkt). (B) Die Zellviabilität wurde an MC38-Mauskolonkarzinomzellen, die stabil das humane karzinoembryonale Antigen und den MV-Rezeptor CD46 exprimieren (MC38-CEA-CD46), nach Inokulation mit Medium allein (Mock) oder den angegebenen Viren bei einem MOI von 1 untersucht. Der XTT-Zellviabilitätstest wurde zu den angegebenen Zeitpunkten durchgeführt. Bei früheren Zeitpunkten zeigte sich eine stärkere Abnahme der Zellviabilität für den nicht modifizierten Vektor. Werte über 100 %, wie sie für MV-H-mCD3xhCD20 zum Zeitpunkt 12 h berechnet wurden, werden kurz nach der Infektion häufig beobachtet und könnten auf zellulären Stress oder zelluläre Faktoren in der Virus-Suspension zurückzuführen sein. Für jeden Zeitpunkt sind die Mittelwerte inklusive Standardabweichungen von drei technischen Replikaten dargestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021	Zum Aussäen und Infizieren von Vero-Zellen verwendet
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biosera, Boussens, Frankreich	FB-1280/500	Zur Supplementierung von DMEM
Vero-Zellen	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81	Wirtszellen für die Vermehrung und Analyse von Masernvirus
12-Loch-Platten	Neolab, Heidelberg, Deutschland	353043	Zum Aussäen von Vero-Zellen (1 × 10⁵ pro Loch)
Opti-MEM (serumfreies Medium)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Deutschland	31985070	Für den Virusinfektionsschritt (serumfreie Inkubation)
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Deutschland	14190-094	Zum Waschen und zur Mediumzubereitung
Zellabheber	Corning, Reynosa, Mexiko	3008	Zum Abkratzen infizierter Zellen bei der Ernte verwendet
50-mL-Röhrchen	nerbe plus, Winsen/Luhe, Deutschland	02-572-3001	Für Probenentnahme und Zentrifugation
Flüssigstickstoff	—	—	Zum Sofortgefrieren der geernteten Virusproben
Zentrifuge (fähig zu 2.500 × g)	—	—	Zum Pellettieren von Zelltrümmern
XTT-Zellviabilitätskit (Farbmetrisches Zellviabilitätskit III)	PromoKine, Heidelberg, Deutschland	PK-CA20-300-1000	Enthält XTT-Reagenz; zur Messung der Zytotoxizität
96-Loch-Platten, flachbodig	Neolab, Heidelberg, Deutschland	353072	Für die Absorptionsmessung bei 450 nm
Spektralphotometer / Mikroplattenreader	—	—	Zur Messung der optischen Dichte bei 450 nm (Referenz 630 nm)
Kohlendioxid-Inkubator	—	—	37 °C, 5 % CO₂ für alle Zellinkubationen