Evaluierung der immunmodulatorischen Aktivität eines viral kodierten bispezifischen T-Zell-Engagers

Zusammenfassung

Quelle: Heidbuechel, J. P., et al. Paramyxoviren für die tumorspezifische Immunmodulation: Design und Evaluierung ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert einen zellbasierten Assay zur Beurteilung der zielgerichteten immunmodulatorischen Aktivität eines viral kodierten bispezifischen T-Zell-Engagers (BTE). Der BTE verbindet Tumorzellen, die einen Zielrezeptor exprimieren, mit T-Zellen und löst dadurch die Lyse der Tumorzellen und die Freisetzung von Enzymen aus. Ein farbmetrischer Endpunkt, basierend auf der Umwandlung eines Substrats, zeigt die Aktivierung der T-Zellen an. Eine stärkere Farbintensität in der Testprobe bestätigt die BTE-vermittelte, rezeptorspezifische Immunaktivierung.

Protokoll

1. Beurteilung der immunologischen Funktionalität isolierter Immunmodulatoren.
   1. Im Folgenden wird detailliert beschrieben, wie die durch einen bispezifischen T-Zell-Engager (BTE) induzierte, zellvermittelte Zytotoxizität mittels Lactatdehydrogenase-(LDH)-Freisetzungs-Assay bewertet wird.
      1. Legen Sie die Bedingungen fest, die während des Experiments getestet werden sollen (siehe Abbildung 1 als Beispiel). Zeitpunkte (Stunden bis Tage), Konzentrationen des Immunmodulators (pg/mL bis µg/mL) und Effektor-zu-Target-Zell-Verhältnisse (E:T) (z. B. zwischen 1:50 und 50:1) können variiert werden. Bereiten Sie die Proben stets im Dreifachansatz vor.
      2. Schließen Sie Proben ohne BTE-Protein und ohne Effektorzellen ein, Kontrollen für die spontane LDH-Freisetzung der einzelnen Zelltypen (Tsp und Esp), eine Kontrolle für die maximale Lyse der Targetzellen (Tmax) mit vor dem Messzeitpunkt zugesetztem Detergens, eine Kontrolle mit Medium allein sowie eine Volumenkontrolle für Tmax ein.
         HINWEIS: Die erforderliche Anzahl an Targetzellen und Inkubationszeiten kann variieren. Führen Sie anfängliche Testläufe ohne Effektorzellen und Immunmodulatoren durch, um optimale Parameter zu ermitteln. Schließen Sie Tsp- und Tmax-Proben sowie entsprechende Kontrollen ein, um unterschiedliche Zellzahlen und Zeitpunkte zu bewerten.
      3. Isolieren Sie immunvermittelnde Effektorzellen (z. B. durch Dichtegradientenzentrifugation von menschlichem Blut zur Gewinnung peripherer mononuklearer Blutzellen (PBMCs) oder durch negative Selektion muriner T-Zellen aus Maus-Milzzellen).
      4. Säen Sie Targetzellen (z. B. 5 x 10³ pro Vertiefung) in eine U-förmige 96-Well-Platte aus.
      5. Fügen Sie das isolierte Protein in gewünschten Konzentrationen den entsprechenden Proben hinzu. Geben Sie immunvermittelnde Effektorzellen in gewünschten Verhältnissen zu. Fügen Sie Medium hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 µL pro Vertiefung zu erreichen.
      6. Inkubieren Sie für den festgelegten Zeitraum, typischerweise zwischen 4 und 48 h (24 h für nicht stimulierte PBMCs und 48 h für frisch isolierte murine T-Zellen; kürzere Inkubationszeiten können für vorgestimulierte Immunzellen gelten), bei 37 °C und 5 % CO₂.
      7. 45 Minuten vor der Probensammlung 10 µL 10x-Lyselösung zu den Vertiefungen mit Tmax-Proben und den entsprechenden Mediumkontrollen hinzufügen. Inkubation fortsetzen.
      8. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 x g für 4 min. Übertragen Sie 50 µL des jeweiligen Überstandes in eine flache 96-Well-Platte. Übertragen Sie keine Zellen, um zellgebundenes LDH zu vermeiden.
      9. Bereiten Sie die Substratlösung gemäß den Herstelleranweisungen vor. Geben Sie 50 µL in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur [RT] im Dunkeln für 30 min oder bis die Tmax-Proben tiefrot gefärbt sind.
      10. Geben Sie 50 µL Stopplösung in jede Vertiefung. Entfernen Sie Luftblasen durch Zentrifugation für 1 min bei 4.000 x g und manuell mit einer Hohlnadel. Messen Sie die optische Absorption bei 490 nm.
      11. Berechnen Sie die Werte für die prozentuale spezifische Lyse für jede Probe.
          1. Berechnen Sie die Mittelwerte der Replikate der Mediumkontrollen mit und ohne Lyselösung. Subtrahieren Sie die erhaltenen Werte jeweils von den experimentellen Proben sowie von den Tmax- und Spontanfreisetzungs-Kontrollen. Verwenden Sie diese hintergrundkorrigierten Werte für weitere Berechnungen.
          2. Berechnen Sie die Mittelwerte der hintergrundkorrigierten Tmax-, Tsp- und Esp-Kontrollen. Mithilfe dieser Mittelwerte ergibt die folgende Gleichung den Prozentsatz der spezifischen Lyse für jede Probe:
             
          3. Tragen Sie die Werte der prozentualen spezifischen Lyse gegen die Protein-Konzentration oder das E:T-Verhältnis auf und vergleichen Sie sie mit den nicht-zielgerichteten Kontrollproben.

Ergebnisse

Abbildung 1: Zytotoxische Aktivität von Measeln-Virus-kodierten BTEs. Ziel-Tumorzellen (5 x 10³ B16-CD20-CD46-Zellen pro Vertiefung) wurden mit murinen T-Zellen im Verhältnis 1:50 inkubiert. BTEs (bispezifische T-Zell-Engager), zuvor aus dem Überstand von MV(Measles virus)-H-mCD3xhCD20-infizierten Zellen gereinigt, wurden in den angegebenen Konzentrationen zugegeben. Die relative Lyse der Zielzellen wurde nach 48 h mittels LDH-Freisetzungs-Assay bestimmt. Zellen, die das BTE-Zielantigen fehlten (B16-CD46), dienten als Referenz zur Beurteilung der antigenspezifischen Zytotoxizität. Dargestellt sind Mittelwerte plus Standardabweichungen von drei technischen Wiederholungen pro Probe. Zielzellen, die das Zielantigen exprimierten, wurden in einer BTE-Konzentrations-abhängigen Weise spezifisch lysiert. Die Reinheit des BTE-Produkts und die Expressionshöhe des Zielantigens beeinflussen die Zelltötung. Im vorliegenden Beispiel wurde bei einer relativ hohen BTE-Konzentration von 1 µg/mL eine spezifische Zelltötung von 15 % erreicht. Dieser Wert ist typisch für einen solchen experimentellen Aufbau mit langen Mitinkubationszeiten und suboptimalen T-Zell-Kulturbedingungen. In anderen Versuchsbedingungen wurde mit aus MV-infizierten Überständen gereinigten BTEs eine spezifische Tötung von bis zu 60 % erreicht, wobei ein Plateau bei BTE-Konzentrationen von 100 ng/mL und höher beobachtet wurde. Dies zeigt, entgegen der Intuition, dass die Obergrenze dieses Assays unter 100 % spezifischer Lyse liegt, was durch unterschiedliche Wachstumsdynamiken in den Tmax-Kontrollen im Vergleich zu den Kokulturproben erklärt werden kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Deutschland	31966-021
Fötales Kälberserum (FBS)	Biosera, Boussens, Frankreich	FB-1280/500
Kanamycin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland	K0129
B16-CD46/ B16-CD20-CD46	J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg		auf Anfrage erhältlich
Farbmetrisches Zellviabilitätskit III (XTT)	PromoKine, Heidelberg, Deutschland	PK-CA20-300-1000	enthält XTT-Reagenz
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Deutschland	14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin-Säulen	QIAGEN, Hilden, Deutschland	31014
96-Well-Platten, U-Boden	TPP, Trasadingen, Schweiz	92097
96-Well-Platten, flacher Boden	Neolab, Heidelberg, Deutschland	353072