Fluoreszierende Funktionalisierung von virusähnlichen Partikeln durch Disulfid-Re-Bridging

Zusammenfassung

Quelle: Chen, Z., et al. Herstellung von konjugationsinduzierten fluoreszierenden pegylierten Virus-ähnlichen Partikeln mittels Dibromomaleimid-Disulfid-Chemie. J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video wird die fluoreszente Funktionalisierung von virusähnlichen Partikeln durch das Wiedervernetzen reduzierter Disulfide mit einem Polyethylenglykol (PEG)-Linker gezeigt, wodurch stabile, verfolgbare Konjugate entstehen, die für die zelluläre Bildgebung und gezielte Abgabe in biomedizinischen Anwendungen geeignet sind.

Protokoll

1. Konjugation von Dibromomaleimid-(DB)-Verbindungen an Bakteriophagen Qβ

1. Reduzieren Sie Disulfide an Qβ.
   1. Lösen Sie 0,0020 g Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) in 1 mL ultrareinem Wasser, um eine 100x-Stammlösung herzustellen.
      HINWEIS: Bereiten Sie TCEP frisch vor der Reduktion zu.
   2. Geben Sie 200 µL Qβ (5 mg/mL) in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Gegeben Sie anschließend 20 µL der 100x TCEP-Stammlösung hinzu.
   4. Inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur.
2. Wiederherstellen der reduzierten Disulfidbrücken mittels Dibromomaleimid-Polyethylenglykol (DB-PEG).
   1. Lösen Sie 0,0017 g Dibromomaleimid-Polyethylenglykol (DB-PEG) in 100 µL DMF.
   2. Geben Sie 680 µL einer 10 mM Natriumphosphatlösung (pH 5) hinzu.
   3. Geben Sie reduziertes Qβ in die DB-PEG-Lösung und beobachten Sie den Mischvorgang unter einer 365 nm UV-Lampe. Die intensive gelbe Fluoreszenz ist unmittelbar nach dem Mischen mit einer tragbaren 365 nm UV-Lampe sichtbar.
   4. Lassen Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur (RT) auf einem Rotisserie-Inkubator laufen.
3. Reinigen Sie das Reaktionsgemisch dreimal mittels Zentrifugalfilter (Molekulargewichts-Cutoff (MWCO) = 10 kDa) mit 1x PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) bei 3.283 × g für 20 min bei 4 °C.
4. Überwachen Sie die Konjugation mittels nicht-reduzierender SDS-PAGE (Natriumlaurylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) und nativer Agarose-Gelelektrophorese.
   HINWEIS: VLPs (virusähnliche Partikel) wandern im nativen Agarosegel als intakte Partikel und werden basierend auf ihrer Ladung, Größe und Form getrennt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2,3-Dibromomaleimid 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Polyethylenglykol	Alfa Aesar	41561-22
Natriumphosphat	Fisher Scientific	AC424375000
Acrylamid/Bis-Acrylamid	P212121	RP-A11310-500.0
Natriumlaurylsulfat	Sigma Aldrich	L3771-100G
Ammoniumpersulfat	Fisher Scientific	BP179-100
Amicon Ultra-4 Zentrifalfiltereinheiten	Millipore Sigma	UFC801024
Falcon 15-mL-Kegelzentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-959-53A
Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 Orbitalschüttler	VWR Scientifc Products	14005-830
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
P200 Pipetman	Gilson	F123601
P100 Pipetman	Gilson	F123615
P20 Pipetman	Gilson	F123600
P10 Pipetman	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 Laborwaage, klassische Laborhochpräzisionswaage	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100