Gewinnung infektiöser Virionen aus Zellen, die mit synthetischer RNA aus bakteriellen künstlichen Chromosomen transfiziert wurden

Zusammenfassung

Quelle: Yun, S. et al. Bakterielle künstliche Chromosomen: Ein funktionelles Genomik-Tool für die Untersuchung von positiv-sense-RNA-Viren. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt die Gewinnung infektiösen japanischen Enzephalitisvirus aus synthetischer RNA, die aus einem bakteriellen künstlichen Chromosomenklon transkribiert wurde. Es veranschaulicht, wie Zellen mit der synthetischen RNA elektroporiert werden, wodurch das virale Genom die Produktion neuer Virionen steuern kann. Die entstandenen Plaques in infizierten Zellmonolagen bestätigen die erfolgreiche Isolierung des infektiösen Virus.

Protokoll

1. Bestimmung der RNA-Infektiosität und des Virusausbeute

1. Kultivieren Sie Baby-Hamster-Niere-21 (BHK-21)-Zellen in 150-mm-Kulturschalen bei einer Dichte von 3 × 10⁶ Zellen/Schale für 24 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   HINWEIS: Pflegen Sie die BHK-21-Zellen in alpha-Minimal-Essential-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, Vitaminen und Penicillin/Streptomycin.
2. Spülen Sie die Zellmonolage mit 10 ml kalter Lösung A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄ und 1,5 mM KH₂PO₄). Lösen Sie die Zellen durch Behandlung mit 4 ml Trypsin-Ethylenendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,25 %) von den Schalen ab und sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 270 × g in einer Tischzentrifuge für 2 Minuten.
3. Suspendieren Sie das Zellpellet in einem 50-ml-Kegelröhrchen mit 50 ml kalter Lösung A und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 270 × g für 2 Minuten. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal; nach dem letzten Waschgang suspendieren Sie das Zellpellet bei einer Dichte von 2 × 10⁷ Zellen/ml in Lösung A.
4. Mischen Sie ein 400-µl-Aliquot der Zellsuspension mit 2 µg synthetischer RNA in einer 2-mm-Spaltküvette und elektroporieren Sie das Gemisch unverzüglich mit einem Elektroporator unter optimalen Elektroporationsbedingungen: 980 V, 99 µsec Impulsdauer und 5 Impulse (Abbildung 1C).
5. Lassen Sie die elektroporierten Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) stehen und überführen Sie sie in ein 1,7-ml-Mikroröhrchen, das 600 µl vollständiges Kulturmedium enthält.
6. Stellen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der elektroporierten Zellen in 1 ml vollständigem Kulturmedium her und geben Sie jeweils ein 100-µl-Aliquot jeder Verdünnung auf die Monolagen unbehandelter BHK-21-Zellen (5 × 10⁵) in einer 6-Loch-Platte.
7. Nach 4–6 Stunden Inkubation überdecken Sie die Zellen mit 0,5 % Agarose in Minimal-Essential-Medium, das 10 % fetalem Kälberserum enthält. Inkubieren Sie die Platten 4 Tage bei 37 °C mit 5 % CO₂.
8. Visualisieren Sie die infektiösen Zentren (Plaques) durch Fixierung mit 7 % Formaldehyd und Färbung mit 1 % Kristallviolett in 5 % Ethanol (Abbildung 2A).
   1. Optional: Untersuchen Sie die mit RNA-elektroporierten Zellen 18–20 Stunden nach der Transfektion auf Expression von Proteinen des Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) mittels Immunfluoreszenztests (Abbildung 2B) und gewinnen Sie die Überstände der mit RNA-elektroporierten Zellen nach 22 und 40 Stunden post Transfektion zur Virus-Titrierung mittels Plaque-Assays (Abbildung 2C).

Ergebnisse

Abbildung 1. Übersicht über die Gewinnung infektiöser Viren aus einer vollständigen komplementären DNA (cDNA) des JEV SA₁₄-14-2, die in einem bakteriellen künstlichen Chromosom (BAC) zusammengefügt wurde. (A) Linearisierung der cDNA-Vorlage. Die vollständige JEV-BAC-DNA wird mit XbaI geschnitten und anschließend mit Mung-Bohnen-Nuklease (MBN) behandelt. (B) Synthese der RNA-Transkripte. Die linearisierte cDNA wird mittels SP6-RNA-Polymerase in Gegenwart des m⁷G(5')ppp(5')A Kap-Analogs transkribiert. (C) Gewinnung der synthetischen JEVs. Die in vitro transkribierten RNAs werden durch Elektroporation in BHK-21-Zellen transfiziert, wodurch eine hohe Viruslast an synthetischem Virus entsteht.

Abbildung 2. Spezifische Infektiosität der synthetischen RNAs, transkribiert aus einem vollständigen JEV-BAC, und die Gewinnung synthetischen Virus. BHK-21-Zellen werden als Kontrolle elektroporiert (Mock) oder mit RNA-Transkripten, die von jeweils zwei unabhängigen Klone des vollständigen JEV-BAC stammen (Cl.1 und Cl.2), elektroporiert. (A) RNA-Infektiosität. Die Zellen werden mit Agarose überzogen und vier Tage nach der Transfektion mit Kristallviolett angefärbt. Die RNA-Infektiosität wird mittels Infektionszentren-Assays bestimmt, um die Menge an infektiöser RNA abzuschätzen, die in die Zellen elektroporiert wurde (linkes Panel). Zudem werden repräsentative Bilder der Infektionszentren gezeigt (rechtes Panel). (B) Proteinexpression. Die Zellen werden in 4-Well-Kammern auf Objektträgern kultiviert. Die virale Proteinexpression in RNA-elektroporierten Zellen 20 Stunden nach der Transfektion (hpt) wird mittels Immunfluoreszenz-Assays analysiert, unter Verwendung eines primären Kaninchen-Antiserums gegen das nichtstrukturelle Protein 1 (NS1) und eines sekundären mit Cy3 konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulins G (IgG) (rot). Die Kerne werden mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol kontrastgefärbt (blau). Die Immunfluoreszenzbilder werden über die entsprechenden Bilder des differentiellen Interferenzkontrasts gelegt. (C) Virusausbeute. Die Zellen werden in 150-mm-Zellkulturschalen kultiviert. Die Produktion infektiöser Virionen, die sich in den Kulturüberständen der RNA-elektroporierten Zellen 22 und 40 Stunden nach der Transfektion (hpt) angesammelt haben, wird mittels Plaque-Assays untersucht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alpha Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Agarose	Lonza	50004
Konischer Zylinder (50 mL)	VWR	21008-242
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C0775
Kulturschale (150 mm)	TPP	93150
Küvette (2-mm-Spalt)	Harvard Apparatus	450125
Fötales Rinderserum	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F1635	Toxisch und krebserregend
Glutamin	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P3911
Monobasische Kaliumphosphat	Sigma-Aldrich	P9791
Sechslochplatte	TPP	92006
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S3014
Dibasische Natriumphosphat	Sigma-Aldrich	S3264
Trypsin-EDTA (0,25 %)	Life Technologies (Gibco)	25200-056
Vitamine	Sigma-Aldrich	M6895
CO₂-Inkubator	Thermo Scientific	Heracell 150i
Schreibtischzentrifuge	Thermo Scientific	ST16R
Elektroporator	Harvard Apparatus	ECM 830