Zur Beurteilung der In vivo Effekte von therapeutischen Interventionen für Muskelerkrankungen, sind Methoden notwendig, um Krafterzeugung und Ermüdbarkeit bei behandelten Muskeln zu quantifizieren. Wir Detail einen Ansatz zur Bewertung von myo-mechanischen Eigenschaften in explantierten Maus Hinterlauf Muskel. Diese Analyse liefert ein robustes Konzept für die Quantifizierung der Auswirkungen der genetischen Veränderung auf die Muskelfunktion, sowie Vergleich der Therapien in Mausmodellen der Muskelerkrankung.
Methodenartikel
Myo-mechanischen Analyse von isolierten Skelettmuskel
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zur Beurteilung der in vivo-Effekte von therapeutischen Interventionen für die Behandlung von Muskelerkrankungen 1,2,3, sind quantitative Methoden notwendig diese Maßnahme Krafterzeugung und Ermüdbarkeit bei behandelten Muskeln. Wir beschreiben eine detaillierte Vorgehensweise bei der Bewertung myo-mechanischen Eigenschaften in frisch explantierten Hinterlauf Muskel von der Maus. Wir beschreiben die atraumatische Ernte der Maus extensor digitorum longus, der Montage der Muskel in einem Muskel Streifen Myographions (Model 820MS; Danish Myo Technology) und die Messung der maximalen zucken und tetanischen Spannung, Kontraktion der Zeit, und Halb-Relaxationszeit, mit einem Rechteckimpuls Stimulator (Modell S48; Grass Technologies). Mit diesen Messungen zeigen wir die Berechnung der spezifischen zucken und tetanischen Spannung normiert auf Muskel-Querschnittsfläche, die twitch-to-tetanische Spannungsverhältnis, 4 die Kraft-Frequenz-Beziehung-Kurve und der niedrigen Frequenz Ermüdungskurve. Diese Analyse stellt eine Methode zur quantitativen Vergleich zwischen therapeutischen Interventionen in Mausmodellen von Muskelerkrankungen 1,2,3,5, sowie Vergleich der Auswirkungen der genetischen Veränderung auf die Muskelfunktion 6,7,8,9.
Protokoll
Das Protokoll ist mit der Zustimmung der UCSF Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt.
1. Die Präparation der Maus extensor digitorum longus (EDL) Muscle
- Führen Sie alle tierischen Verfahren in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts.
- Euthanize Tier mit 200 mg / kg intraperitoneal Pentobarbital / Genickbruch kurz vor Muskel-Ernte 10. Die Dissektion sollte geübt werden, so dass der Muskel geerntet werden kann und montiert in der Spannung Wandler innerhalb von 15 Minuten der Euthanasie.
- Vereinbaren Kadaver in Rückenlage auf Dissektion Tablett und Stift Bein zu Boden.
- Unter Dissektionsmikroskop, offene Haut, vorsichtig öffnen Faszie (Abb. 1a), und schälen tibialis vom Knöchel aufwärts bis EDL (Abb. 1b) aussetzen. Verwenden Tropfen Ringer-Laktat-Lösung, um den Muskel feucht und gepuffert bei der Ernte.
- Entfernen Sie EDL, die Erhaltung soviel Sehne wie möglich an jedem Ende, und in eine Petrischale mit Ringer-Laktat-Lösung. Tie Naht zu jedem der Muskelsehnen (Fig.1C). Es ist wichtig, dass die Muskelfasern nicht berührt oder gestört während der Präparation.
2. Die Montage der Maus EDL im Muscle-Streifen Myographions
- Für diese Studien ist ein Gewebe Bad benötigt, schützt den Muskel während es beim in physiologischer Lösung bei konstanter Temperatur zu baden mit kontinuierlicher Sauerstoffzufuhr. Das Bad ist mit einem Kraftaufnehmer zur Messung der Muskelspannung gekoppelt. Wir beschäftigen ein integriertes Muskel Streifen Myographions Bad aus dem Dänischen Myo Technology (DMT-Modell 820MS) für diesen Zweck. Darüber hinaus sind ein Rechteckimpuls elektrischen Stimulator (Grass Modell S48) und Datenerfassung Plattform (ADInstruments PowerLab Data Acquisition System und LabChart Software) erforderlich, um zu entlocken, aufzuzeichnen und zu analysieren myo-mechanische Reaktionen bzw.. Die DMT 820MS hat Platin-Elektroden in die Kammer Abdeckung, die auf beiden Seiten des Muskels positioniert sind, in den mittleren Teil des Muskels Streifen integriert. Andere Myogrammgeräte erfordern besondere Aufmerksamkeit auf die Platzierung der Elektroden.
- Füllen Myographions Bad mit 5 ml Krebs Henseleit-Lösung 11. Warm bis 25 ° C. Bubble-O 2 / CO 2 (95% / 5%) über Bad für 15 Minuten vor dem Gebrauch.
- Verwenden Nähte EDL zwischen den Klemmen des Myographions erweitern und sichern die Sehnen der EDL Muskel (Fig.1D, E) zwischen den Klemmen. Achten Sie darauf, den Muskel selbst zu klemmen.
- Pflegen Sie Myographions Bad bei 25 ° C
3. Myo-mechanischen Analyse
A. Twitch Spannung
- Set ursprünglichen Länge in das Bad so, dass es keinen Muskel Laxheit.
- Bestimmen Sie maximale Reiz (Dauer 0,5 ms) durch Anpassung Spannung, um eine maximale Zuckung Spannung zu erhalten, dann Stimulus bei 20% über maximal (bis supramaximale Stimulus zu erreichen) eingestellt. In unseren Studien ist die supramaximale Stimulus in der Regel bei einer Leistung von 40 Volt erreicht.
- Stellen Sie sicher, Ausgabe vom Stimulator mit einem Oszilloskop.
- Bestimmen Sie die optimale Länge durch die schrittweise Dehnung der Muskeln, bis keine weitere Steigerung der twitch Spannung.
- Lassen Muskel für 3 min ins Gleichgewicht.
- Deliver supramaximale Platz Stimulus (0,5 ms) bei optimaler Länge mit Grass S44 elektronische Stimulator und Record-Ausgang.
- Rekord: twitch Spannungskurve (P t gegen die Zeit; Abb.2a).
B. Tetanus Spannung
- Lassen Muskel für 3 Minuten ruhen lassen.
- Tragen Sie einen Zug der supramaximale Impulse für 300msec bei 150 Hz auf optimale Länge mit Grass S44 elektronische Stimulator und Record-Ausgang.
- Rekord: Tetanus-Spannungskurve (P o gegen die Zeit; Abb.2b).
C. Force-Frequenz
- Lassen Muskel für 3 Minuten ruhen lassen.
- Force-Frequenz: apply Züge supramaximale Stimuli bei 30, 60, 100, 140 und 160 Hz mit 3 Minuten Pause zwischen jedem Reiz (Abb. 3). Alternativ können Züge 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 und 160 Hz für eine bessere Auflösung bei niedrigeren Frequenzen, wo Kraft wesentlich ändert angewendet werden.
- Plot: Kraft-Frequenz-Beziehung (% der maximalen Kraft vs Stimulationsfrequenz).
D. Fatigue
- Bewerben Zug kurzer tetani: 60 Hz für 300 ms (oder Frequenz angepasst werden, um 50% der maximalen Kraft zu erzeugen), alle 3 Sekunden für 10 Minuten. Mit 10 Minuten sollte die tetanischen Kraft auf ein Plateau von ca. 15% des Ausgangswertes (Abb. 4) abnehmen.
- Plot: niederfrequenten Müdigkeit (% der maximalen Kraft gegen die Zeit).
E. Zusätzliche Datenerfassung am Ende des Protokolls
- Vor Aushängen der Muskel aus dem Myographions, stellen Sie den muscle bei optimaler Länge, wie in Schritt III.A.4 bestimmt und messen deren Durchmesser entweder mit einem Okular am Mikroskop oder mit einem Messschieber. Berechnen Querschnittsfläche (um 2).
- Messen Sie Muskelmasse (mg), indem Sie Fäden und einem Gewicht von Muskeln.
- Wiegen Maus Körpermasse (gm) zu beurteilen.
4. Berechnungen
- Muscle: Körper-Masse-Verhältnis =
Muskelmasse / Körpermasse - Twitch Spannung, P t (Mn) =
maximale Spannung während zucken generiert - Spezifische zucken Spannung (N / cm 2) =
twitch (mN) / Querschnittsfläche (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 - Time to Peak Spannung (ms) =
Zeit vom Beginn der Kontraktion um eine maximale Spannung - Half-Relaxationszeit (ms) =
Zeit von der Spitze Spannung auf 50% der maximalen Spannung - Tetanische Spannung, P O (mn) =
maximale Spannung während des Tetanus erzeugt - Spezifische tetanische Spannung (N / cm 2) =
tetanische Spannung (mN) / Querschnittsfläche (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 - Maximale Geschwindigkeit des Anstiegs des Tetanus (N / s) =
Höchstsatz für die Erhöhung der Spannung während der die Spannung steigt in Tetanus, dh die maximale Steigung der tetanischen Spannung-Kurve (oder, dP O / dt) - Half-Entspannung tetanische Spannung (ms) =
Zeit vom Aufhören der Stimulation auf 50% der Spannung am Ende der Stimulation - Twitch Spannung-zu-tetanische Spannungsverhältnis, P t / P O =
maximale zucken Zug / maximale tetanische Spannung - Fatigue index =
Verhältnis von Spannung nach zwei Minuten von niederfrequenten Müdigkeit bis zur maximalen isometrischen Spannung
5. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Dissection von EDL Muskeln. A, Exposure der Hinterlauf muscles.TA, tibialis anterior. B, Exposure von EDL (extensor digitorum longus) Muskeln. C, Befestigung der Nähte zu EDL Sehnen. D, Zugmessdose Bad (Ansicht von der Seite). E, montiert EDL in Bad (Ansicht von oben). Der Muskel in unvollständig in den Puffer zu illustrativen Zwecken eingetaucht, in der Praxis, der Muskel sollte vollständig eingetaucht werden, um ein Austrocknen zu verhindern.
Abbildung 2. Beispiel für Spannungsbögen. A, Beispiel zucken Spannung Kurve, maximal zucken Spannung (P t), Kontraktion der Zeit (CT) und Halb-Relaxationszeit (HRT). Bar, 1 sh. B, Beispiel tetanische Spannung Kurve maximale tetanische Spannung (P o) und Halb-Entspannung tetanische Spannung (HRTT). Bar, 1s.
Abbildung 3. Beispiel für Kraft-Frequenz-Beziehung Analyse. A, die Spannungen durch inkrementelle Stimulation Frequenzen erzeugt. B, Beispiel Impulsfolge bei 30MHz. Bar, 80ms. C, Beispiel für Impulsfolge bei 140MHz. Bar, 80ms. D, Beispiel Kraft-Frequenz-Kurve von Daten in A gezeigt abgeleitet. Die Form der Kraft-Frequenz-Kurve ist charakteristisch für Muskelkraft, und kann zwischen den Muskeln von verschiedenen Tieren verglichen werden.
Abbildung 4. Beispiel für niedrige Frequenz Ermüdungsanalyse. A, Decremental Spannungen über einen Zeitraum von niederfrequenten stimulation.Examples von Impulsfolgen bei angegebenen Zeitpunkten (B, C, D) erzeugt werden unten gezeigt. E, Beispiel für niederfrequente Ermüdungskurve von Daten in A gezeigt abgeleitet. Die Form der niederfrequenten Ermüdungskurve ist charakteristisch für Muskelkraft, und kann zwischen den Muskeln von verschiedenen Tieren verglichen werden.
Diskussion
Wir beschreiben eine detaillierte Vorgehensweise bei der Bewertung myo-mechanischen Eigenschaften in explantierten Hinterlauf Muskel von der Maus. Die EDL, während schwieriger, wegen seiner hinteren Position hinter dem M. tibialis anterior zu sezieren, ist leichter zu beurteilen als die tibialis anterior wegen seiner prominenten Sehnenansätze bis zum Knöchel-und Kniegelenke. Diese Sehnen erleichtern in den Muskel Streifen Myographions Montage. Im Gegensatz dazu hat die leichter zugänglich tibialis anterior eine breite, fast atendinous Befestigung am Kniegelenk, so dass es außerordentlich schwierig, beide ohne die Muskeln zu zerlegen und montieren sicher in der Myographions. Wir weisen auch darauf hin, dass schnell die Montage der Muskel in ein mit Sauerstoff angereichertes Bad in einem physiologischen Puffer und Temperatur ist von wesentlicher Bedeutung für die Erhaltung der Muskulatur der mechanischen Eigenschaften. Wir haben festgestellt, dass wir diese Analyse für bis zu 30 Minuten wiederholen, ohne signifikante Veränderungen im Muskel Reaktion unter diesen Bedingungen. Schließlich ist es wichtig, dass die Muskelfasern nicht während der Präparation und Befestigung Verfahren berührt werden, da dies negative Auswirkungen auf die Muskelfunktion haben kann, und das Ergebnis in Unterschätzung der myo-mechanische Kraft. Durch die folgenden Verfahren, bietet diese Analyse ein robustes quantitative Ansatz zur Bewertung der Auswirkungen der genetischen Veränderung auf die Muskelfunktion 6,7,8,9, sowie Vergleich zwischen therapeutischen Interventionen in Mausmodellen von Muskelerkrankungen 1,2,3,5 .
Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Public Health Service Grant (HL086513) aus NHLBI zu PEO und ein umfassendes Research Grant aus dem California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), eine Public Health Service Grant (HL085377) aus NHLBI unterstützt, und ein Geschenk aus dem Pollin Stiftung HSB
SC wurde von einem California Institute for Regenerative Medicine Bridges unterstützt, um Cell Research Award (TB1-01194) nach San Francisco State University Stem.
Materialien
Lösungen und Medien
Ringer-Laktat-Lösung
- 100 mM NaCl
- 30 mM CH3CH (OH) COONa (Natriumlactat)
- 4 mM KCl
- 1 mM CaCl 2 · 2H 2 O (Calciumchlorid Dihydrat)
- pH-Wert einstellen auf 6,75
Krebs Henseleit-Lösung
- 118 mm NaCl
- 4,7 mM KCl
- 1,25 mM CaCl 2
- 1,2 mM MgCl 2
- 1,2 mM KH 2 PO 4
- 25 mM NaHCO 3
- 11 mM Glukose
- pH-Wert auf 7,2-7,4 durch Äquilibrieren mit O 2 / CO 2 (95% / 5%) Gas
Pentobarbital
- 5 mg / mL funktionierende Lösung in sterilem Wasser
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
