Übung ist in der Lage die Apoptose in Immunzellen. Es gibt verschiedene Mess-Beschränkungen, insbesondere in Bezug auf die benötigte Zeit zu isolieren und zu behandeln, eine Blutprobe vor der Bewertung. Nachgewiesene ist eine schnelle und minimal-invasives Verfahren für die Analyse von belastungsinduzierten Lymphozyten Apoptose.
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Methodenartikel
Finger-Stick Blutprobenentnahme Methodik zur Bestimmung der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Übung ist ein physiologischer Reiz der Lage, die Apoptose in Immunzellen. Bis heute haben verschiedene Einschränkungen bei der Messung dieses Phänomens identifiziert worden, insbesondere in Bezug auf die benötigte Zeit zu isolieren und zu behandeln, eine Blutprobe vor der Bewertung des Zelltods. Aus diesem Grund ist es schwierig zu entscheiden, ob gemeldete Anstieg der Immun-Zell-Apoptose, um die tatsächlichen Auswirkungen von Bewegung auf das System kann dazu beigetragen werden, oder sind ein Spiegelbild der Zeit und Verarbeitung notwendig, schließlich erhalten diese Messung. In diesem Artikel zeigen wir eine schnelle und minimal-invasives Verfahren zur Analyse der durch körperliche Belastung ausgelöste Lymphozyten Apoptose. Im Gegensatz zu anderen Techniken wird Vollblut mit einem Antikörper-Panel sofort nach Erhalt einer Probe zugegeben. Nach der Inkubationszeit werden die roten Blutzellen lysiert und die Proben sind bereit, analysiert werden. Die Verwendung eines Finger-Stick Stichprobenverfahren reduziert das Volumen des Blutes benötigt, und minimiert das Unbehagen an Themen.
Protokoll
1. Finger-Stick Blutprobenentnahme
- Sammlung von Vollblut ist in der Regel in Ruhe für eine Baseline-Messung (in der Regel folgende 10-15 min sitzen Rest), während oder unmittelbar nach einer Trainingseinheit, und während der post-Ausübungsfrist genommen (in der Regel 1-3 Stunden nach Beendigung der Übung).
- Mit Universal-Vorsichtsmaßnahmen, zuerst zu sterilisieren der Fingerspitze mit 70% igem Alkohol.
- Als nächstes Punktion der Website mit Hilfe eines automatisierten Lanzette oder einem ähnlichen Gerät. Obwohl wir eine 30-Gauge-Lanzette nach Thema Komfort nutzen, könnte eine größere Nadel verwendet werden.
- Wischen Sie den ersten Tropfen Blut, und dann sammeln Blut in Kapillaren oder microvettes mit Lithium-Heparin behandelt Gerinnen zu verhindern.
2. Zell-Phänotypisierung und Apoptose-Färbung
- Fügen Sie 10 ul heparinisiertem Vollblut titriert Antikörper-Panel in 250 ul Bindungspuffer (siehe Tabelle 1 schematisch). Wir haben eine 1:20 Verdünnung Faktor mit Erfolg eingesetzt, aber jedes Labor sollte ihren Reagenzien titre die besten funktionierende Lösung zu bestimmen.
Tabelle 1. Antikörper-Panel zur Bestimmung der Ausübung-induzierten Apoptose in Leukozyten Teilmengen. Frühe Apoptose wurde durch die Expression von Annexin V definiert, während späte Apoptose durch doppelte positive Markierung mit Annexin V und 7-AAD definiert wurde. Nekrotischen Zellen wurden Annexin V-und 7-AAD + Zellen nur.Tube 1 Tube 2 Rohr 3 Tube 4 Zellen nur Rohr Annexin V - FITC Annexin V - FITC Annexin V - FITC Anti menschlichen CD4 - PE Anti menschliche CD8 - PE Anti menschliche CD19 - PE 7-AAD 7-AAD 7-AAD Anti Menschliche CD45RA - APC Anti Menschliche CD45RA - APC
7-AAD = 7-Amino-Actinomycin D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Helper T-Lymphozyten, CD8 = Suppressor / zytotoxischen T-Lymphozyten, CD19 = B-Lymphozyten, CD45RA = naiv Zellpopulationen, FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin. - Bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten.
- Zentrifuge bei 1075 xg für 5-10 Minuten.
- Dekantieren, zusätzlich 300 ul Red Blood Cell Lysis Buffer, und gründlich vortexen.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
- Geben Sie 300 ul PBS zu RBC Lyse Reaktion zu stoppen.
- Zentrifuge bei 1075 xg für 5-10 Minuten.
- Dekantieren, Rack, und 50 ul Bindungspuffer.
- Analysieren mittels Durchflusszytometrie.
Es wird empfohlen, auf ein Minimum, die folgenden Steuerelemente verwendet werden: a-Zellen nur Röhre als negative Kontrolle bei der Erkennung Hintergrund Autofluoreszenz dienen, und Röhrchen mit jedem einzelnen Fluorochrom auf Entschädigung während der ersten bis der Durchflusszytometer gesetzt. Darüber hinaus haben wir Schadensersatz Standard Perlen erfolgreich zum Aufbau unserer Experimente verwendet.
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Diskussion
Ein minimal-invasive Probennahme und der nachfolgenden Analyse wird für die Analyse der frühen und späten Phasen der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose nachgewiesen. Es ist auch möglich, eindeutig ausschließt diejenigen Zellen, die nekrotisch, und nicht apoptotischer sind. Dieses Verfahren überwindet die Nachteile und Unannehmlichkeiten mit invasive Blutentnahme aus der Ellenbeuge Region zu mehreren Zeitpunkten vor assoziiert, während und unmittelbar nach dem Training oder der Sicherung eines Katheters für die Dauer ...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von einem New Faculty Grant von der Fakultät Scholarship Council an der Western Kentucky University unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Puffer für die Durchflusszytometrie-Bindung | eBioscience | 00-4222-26 | ||
| Erythrozyten-Lysepuffer | eBioscience | 00-4333-57 | ||
| Lanzettvorrichtung | Accu Check Soft Touch | Roche Group | ||
| Kapillarröhrchen | heparinisierte Kapillarröhrchen | Chase Scientific Glass, Inc. | 501 | |
| Zentrifuge | GmC Lab | Gilson, Inc. | PMS-880 | |
| Annexin V-FITC konjugiert | Biovision Inc. | K201-400-1 | ||
| CD4-PE konjugiert | Anti-human, Klon RPA-T4 | eBioscience | 12-0049-42 | |
| CD8-PE konjugiert | Anti-human, Klon OKT8 | eBioscience | 12-0086-73 | |
| CD19-PE konjugiert | Anti-human, Klon HIB19 | eBioscience | 12-0199-42 | |
| 7-AAD Vitalitätsfärbereagenz | eBioscience | 00-6993-50 | ||
| CD45RA-APC konjugiert | Anti-human, Klon HI100 | eBioscience | 17-0458-42 | |
| Durchflusszytometer | C6 | Accuri |
Referenzen
- Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
- Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
- Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
- Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
- Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
- Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
- Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).
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Nachdrucke und Genehmigungen
