Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

Zusammenfassung

Eine effiziente Methode, um hochreine lebensfähig meiotischen Fraktionen aus Maus Hoden zu erhalten, ist beschrieben, die vereint ein raffiniertes Zelle Dissoziation Protokoll mit fluoreszierenden activated cell sorting (FACS). Diese Methode nutzt die Unterschiede in der DNA-Gehalt und nukleare Dichte der diskreten meiotischen Fraktionen.

Zusammenfassung

Die Heterogenität der Zelltypen in den Hoden und das Fehlen von meiotischen Zellkultur-Modellen erhebliche Hürden für die Untersuchung der eindeutigen Unterscheidung Programme, die offenkundig sind während der Meiose worden. Zwei wesentliche Methoden wurden entwickelt, um zu reinigen, in unterschiedlichem Ausmaß, verschiedenen meiotischen Fraktionen von Erwachsenen und Jungtieren: Elutriation oder Staput (Sedimentation) mit BSA und / oder Percoll-Gradienten. Beide Methoden beruhen auf Zellgröße und Dichte zu trennen meiotischen Zellen ^1-5. Insgesamt, abgesehen von wenigen Zellpopulationen ^6, scheitern diese Protokolle, um eine ausreichende Reinheit der zahlreichen meiotischen Zellpopulationen, die für die detaillierte molekulare Analysen ergeben. Darüber hinaus mit solchen Methoden in der Regel eine Art von meiotischen Zellen können zu einer bestimmten Zeit, die eine zusätzliche Ebene der Komplexität in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Homogenität beim Vergleich meiotischen Zellproben fügt gereinigt werden.

Hier beschreiben wir eine raffinierte Methode, die man einfach visualisieren, zu identifizieren und zu reinigen meiotischen Zellen erlaubt, die aus Keimzellen zu runden Spermatiden, mit FACS mit Hoechst 33342 Färbung ^7,8 kombiniert. Diese Methode bietet eine umfassende Momentaufnahme des gesamten meiotischen Prozess und ermöglicht es, hoch zu reinigen lebensfähige Zellen aus den meisten Stadium der Meiose. Diese gereinigten Zellen können dann im Detail für die molekulare Veränderungen, die Progression durch Meiose zu begleiten, zum Beispiel Veränderungen in der Genexpression ^9,10 und die Dynamik der Nukleosomen Belegung an Hotspots der meiotischen Rekombination ¹¹ analysiert werden.

Protokoll

Dieses Protokoll kann in zwei wesentliche Schritte unterteilt werden: (1) die Dissoziation und Hoechst 33342 Färbung der Maus Hoden-Zellen, gefolgt von, wenn nötig, (2) FACS-Sortierung der relevanten meiotischen Fraktionen in allen Phasen der Meiose, die aus Keimzellen zu runden Spermatiden. Einmal erfasst, können diese hoch angereichertes meiotischen Bevölkerung für eine breite Palette von Analysen verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt die Dissoziation von einem Erwachsenen testis; Volumes können dementsprechend für Jugendliche oder für zusätzliche Hoden angepasst werden.

1. Testis Dissoziation

1. Legen Sie eine decapsula....

Diskussion

Das Protokoll hier vorgestellte erlaubt es, gleichzeitig von ausgewachsenen männlichen Mäusen reinigen das gesamte Spektrum der meiotischen Phase-Zellen mit sehr hoher Reinheit, so dass Forscher, die Dynamik dieser grundlegenden Prozess zu studieren. Gereinigte Zellen können für zahlreiche Anwendungen von RNA-Extraktion ^9,10, nucleosome Mapping ^11, rekombinantes Molekül-Erkennung, Protein-Analysen und vieles mehr verwendet werden. Allerdings haben Nachweismethoden auf die Menge an meiotischen Zelle.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kollagenase Typ-1	Worthington Biochemical	CLSS1	In GBSS auf 12.000 U/ml auflösen, bei 4°C lagern
Trypsin	Worthington Biochemical	TRL3	In 1 mM HCl auf 50 mg/ml auflösen, bei 4°C lagern
H–chst 33342	Acros Organics	230001000	Gesättigte Lösung (10 mg/ml in DMSO), bei 4°C lagern
DNase I	Sigma-Aldrich	DNEP	In Wasser/50 % Glycerin auf 1 mg/ml auflösen, bei -20°C lagern
Gey’s Pufferlösung mit physiologischen Salzen	Sigma-Aldrich	G9779
6"-Transferpipette	Fisher Scientific	137119D