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Summary

Eine effiziente Methode, um hochreine lebensfähig meiotischen Fraktionen aus Maus Hoden zu erhalten, ist beschrieben, die vereint ein raffiniertes Zelle Dissoziation Protokoll mit fluoreszierenden activated cell sorting (FACS). Diese Methode nutzt die Unterschiede in der DNA-Gehalt und nukleare Dichte der diskreten meiotischen Fraktionen.

Abstract

Die Heterogenität der Zelltypen in den Hoden und das Fehlen von meiotischen Zellkultur-Modellen erhebliche Hürden für die Untersuchung der eindeutigen Unterscheidung Programme, die offenkundig sind während der Meiose worden. Zwei wesentliche Methoden wurden entwickelt, um zu reinigen, in unterschiedlichem Ausmaß, verschiedenen meiotischen Fraktionen von Erwachsenen und Jungtieren: Elutriation oder Staput (Sedimentation) mit BSA und / oder Percoll-Gradienten. Beide Methoden beruhen auf Zellgröße und Dichte zu trennen meiotischen Zellen ^1-5. Insgesamt, abgesehen von wenigen Zellpopulationen ^6, scheitern diese Protokolle, um eine ausreichende Reinheit der zahlreichen meiotischen Zellpopulationen, die für die detaillierte molekulare Analysen ergeben. Darüber hinaus mit solchen Methoden in der Regel eine Art von meiotischen Zellen können zu einer bestimmten Zeit, die eine zusätzliche Ebene der Komplexität in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Homogenität beim Vergleich meiotischen Zellproben fügt gereinigt werden.

Hier beschreiben wir eine raffinierte Methode, die man einfach visualisieren, zu identifizieren und zu reinigen meiotischen Zellen erlaubt, die aus Keimzellen zu runden Spermatiden, mit FACS mit Hoechst 33342 Färbung ^7,8 kombiniert. Diese Methode bietet eine umfassende Momentaufnahme des gesamten meiotischen Prozess und ermöglicht es, hoch zu reinigen lebensfähige Zellen aus den meisten Stadium der Meiose. Diese gereinigten Zellen können dann im Detail für die molekulare Veränderungen, die Progression durch Meiose zu begleiten, zum Beispiel Veränderungen in der Genexpression ^9,10 und die Dynamik der Nukleosomen Belegung an Hotspots der meiotischen Rekombination ¹¹ analysiert werden.

Protocol

Dieses Protokoll kann in zwei wesentliche Schritte unterteilt werden: (1) die Dissoziation und Hoechst 33342 Färbung der Maus Hoden-Zellen, gefolgt von, wenn nötig, (2) FACS-Sortierung der relevanten meiotischen Fraktionen in allen Phasen der Meiose, die aus Keimzellen zu runden Spermatiden. Einmal erfasst, können diese hoch angereichertes meiotischen Bevölkerung für eine breite Palette von Analysen verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt die Dissoziation von einem Erwachsenen testis; Volumes können dementsprechend für Jugendliche oder für zusätzliche Hoden angepasst werden.

1. Testis Dissoziation

1. Legen Sie eine decapsulated Hoden in einen 15-ml-Tube.
2. Add 3-ml Gey-Balance-Salzlösung (GBSS) mit 120 U / ml Collagenase Typ I.
3. Add 10 ul DNAse I (1mg/ml Stammlösung in 50% Glycerin) und schütteln Sie sie kräftig von Hand, bis Sie Hoden Tubuli beginnen distanzieren sehen.
4. Agitieren horizontal auf einen Höchstbetrag von 120 rpm für 15 min bei 33 ° C.
5. Dekantieren für 1 min vertikal bei Raumtemperatur und Überstand verwerfen.
6. Wiederholen Sie die Schritte 1,2 bis 1,5.
7. Fügen Sie 2,5 ml GBSS mit Collagenase Typ I, 50 ul einer 50mg/ml Trypsin-Stammlösung in 1 mM HCl-Lösung, und 10 ul DNAse I (1mg/ml) resuspendiert und das Röhrchen mehrere Male.
8. Agitieren horizontal auf einen Höchstbetrag von 120 rpm für 15 min bei 33 ° C.
9. Mit Kunststoff-Einweg-Pasteur-Pipette mit breiter Öffnung, Pipette vorsichtig nach oben und unten für 3 min.No Klumpen sichtbar sein soll an dieser Stelle.
10. Add 30 ul Trypsin, 10 ul DNAse I, 40 ul Hoechst 33342 in DMSO (10 mg / ml) resuspendiert und das Röhrchen mehrere Male.
11. Agitieren horizontal auf einen Höchstbetrag von 120 rpm für 15 min bei 33 ° C.
12. Add 400-ul von fötalem Kälberserum (FCS) und mischen durch Invertieren, um Trypsin zu inaktivieren.
13. Finale Färbung wird durch Zugabe von 50 ul Hoechst 33342 resuspendiert in DMSO (10 mg / ml), und 10 ul DNAse I (1 mg / ml) durchgeführt.
14. Agitieren horizontal auf einen Höchstbetrag von 120 rpm für 15 min bei 33 ° C.
15. Die dissoziierten testis Probe wird dann durch zwei 40-um GBSS weitergegeben vorbefeuchtet Einwegfiltern über einen 50-ml konischen Rohr, dann 5 ul von Propidiumiodid (PI)-Lösung hinzugefügt und Probe wird vorsichtig gemischt mit einer Pipette mehrmals mit Einweg-Pasteur Pipette.
16. Die Probe wird auf einer 5-ml Kunststoff-Spritze durch eine 18-Gauge-Nadel übertragen. Letzteres wird durch eine 22-Gauge-Nadel für die Probenvorbereitung Lieferung ersetzt. Die Spritze wird auf Eis gelagert und geschützt vor Licht, bis sie zur FACS Verarbeitung.

2. FACS-Setup und Reinigung

1. Sorting wurde auf einem Becton-Dickinson Aria IIU Zellsortierer durchgeführt. Die beschriebenen Bedingungen sollten daher als Ausgangspunkt verwendet werden, insbesondere wenn mit unterschiedlicher Ausrüstung. Wir haben oben beschriebenen Bedingungen gelten ^7,8.
2. Da die Aria IIU keinen UV-Laser, passten wir das Protokoll zum Nachweis von Hoechst-Färbung mit einem 405nm violetten Laser zusätzlich verwendeten wir eine 488nm blauen Laser für Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Detektion. Darüber hinaus wurden einige Filter modifiziert, um einige rote Laser Undichtigkeit was zu einer verbesserten Streudiagramm Schärfe zu begrenzen.
3. Die violetten Laser mit einer 450/40nm Bandpass für den Nachweis von Hoechst Blau-Emission und eine 585/42nm Bandpass für Hoescht Red Emission konfiguriert. A 502nm langen Pass wurde zur Trennung von Blau von roter Fluoreszenz.
4. A 100 pm Düse wurde mit einem Tropfen Antriebsfrequenz von 28.000 Tropfen / Sekunde. Die Probe Schwelle lag bei rund 4000 Veranstaltungen / Sekunde. Die Temperaturregelung Option wurde für die Probenahme und Sammlung Röhrchen bei 4 ° C zu halten während der gesamten Dauer der Sortierung. Darüber hinaus wurde die Probe Agitation Feature bei 200 Umdrehungen pro Minute verwendet werden, um die Probe aus sedimentierenden der ganzen Art zu verhindern.
5. In der Regel wurden zwei vor drei Hoden pro 6 Stunden sort verarbeitet ermöglicht die Sammlung von 0,5-2.0×10 ⁶ Zellen für jede Population (siehe repräsentativen Abschnitt).
6. Die Probe wurde in Aliquots von ca. 750μl aus der Spritze verzichtet sortiert. In der Zwischenzeit, während dieser Pausen die Sammlung Röhrchen wurden bei 4 ° C, geschützt vor Licht und vorsichtig gemischt vor der Wiederaufnahme zu sortieren.
7. Die sortierten Proben wurden in einem 12x75mm Glas Borosilikatglas Sammlung Röhrchen mit 250μl DMEM mit 10% FCS gesammelt.

3. Repräsentative Ergebnisse:

Ein typisches FACS-Profil ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle wichtigen Schritte der Meiose sind identifiziert und werden in der Legende angegeben. Wenn der Hoechst 33342-Färbung nicht optimal ist, wird das globale Profil erscheinen wesentlich kompakter und weniger definiert. Ein häufiges Problem hinsichtlich nicht ausreichender Zugabe von DNAse, die eine schnelle Zelle Verklumpung auslösen wird. Die Zugabe von zusätzlichen DNAse überhaupt angeklagt Schritte in der Regel löst dieses Problem. Freeze-thawing der DNAse Lager (bei -20 ° C) sollte auf ein Minimum reduziert werden, da dies zu einer raschen Verlust der Enzymaktivität.

Spo11 ist der meiotischen Endonuklease, Doppelstrang-Brüche an den Standorten der meiotischen Rekombination Hotspots ¹² richtet. Abbildung 2 zeigt typische Profile eines Spo11-null Hoden, wo Doppelstrangbruch nicht ausgebildet sind, was zu einer gescheiterten Meiose ^12, sowie eine pre-puberous Profil eines 13-Tage alt Maus, die asynchrone Natur von dieser ersten Welle der Meiose zeigt. Standard-zytogenetische Analysen unter Verwendung der Kombination von synaptonemal komplexe Protein 3 (SCP3) und phosphoryliert Histon-Antikörper H2AX stage-spezifischen Meiose Marker sollten zunächst verwendet werden, um bestätigt die Reinheit und die Art der Sortierung meiotischen Zellen, wie beschrieben Patentrechtsgelehrte ^11.

Abbildung 1. Wildtyp-Meiose FACS-Profilen. A) Repräsentative Streudiagramm dargestellt. Die gated Zellen gezeigt werden. Beachten Sie die große Menge an Schutt in erwachsenen Hoden, die hauptsächlich aus leeren Membranen und Spermatide Schwänze. B) Ein Vertreter PI Plot zeigt die sehr begrenzte Menge an PI-positiven Zellen in einer Probe vorhanden. Die typische Gate wird gezeigt. C) Ein Vertreter Wildtyp-Hoechst 33342 FACS-Profil angezeigt wird. Die verschiedenen meiotischen Zellpopulationen, die unter Verwendung dieser Methode für weitere Untersuchungen werden können, sind angegeben: Spermatogonien (Sp), Pre-Leptotän (PL), Leptotän-Zygotän (L / Z), frühe-Pachytän (EP), Mitte-Pachytän ( MP), Late-Pachytän (LP), Diplotän (D), und runden Spermatiden (RS).

Abbildung 2. Spo11-null-und Wildtyp-Tag 13 meiotischen FACS-Profilen. A) Ein typischer Spo11-null-Profil ist mit einer klaren meiotischen Versagen, in denen keine Bühne hinter dem Leptotän / Zygotän frühen Pachytän erkannt werden können dargestellt. B) Das Profil eines 13-Tage alten Wildtyp-männliche Maus zeigt die hohe Konzentration von Leptotän / Zygotän Zellen. Diese erste Welle der Meiose ist ziemlich asynchron, wie übersichtlich visualisiert mit dieser Methode.

Discussion

Das Protokoll hier vorgestellte erlaubt es, gleichzeitig von ausgewachsenen männlichen Mäusen reinigen das gesamte Spektrum der meiotischen Phase-Zellen mit sehr hoher Reinheit, so dass Forscher, die Dynamik dieser grundlegenden Prozess zu studieren. Gereinigte Zellen können für zahlreiche Anwendungen von RNA-Extraktion ^9,10, nucleosome Mapping ^11, rekombinantes Molekül-Erkennung, Protein-Analysen und vieles mehr verwendet werden. Allerdings haben Nachweismethoden auf die Menge an meiotischen Zellen gereinigt angepasst werden. Darüber hinaus mit der hohen Reproduzierbarkeit dieser Methode ist es möglich, zu bündeln mehrere unabhängige Arten von der gleichen Fraktion an verschiedenen Tagen durchgeführt, um die Menge an Material für ein bestimmtes Experiment erforderlich erhöhen. Außerdem bietet diese Methode Ermittler mit einer einzigartigen visuellen Darstellung des gesamten Meiose, die man zu einer raschen Einschätzung der Auswirkungen genetischer Knockout, Entwicklungsfortschritt Aberration, oder die Wirkung einer bestimmten Behandlung zu beeinflussen Meiose werden sollen (z. B. Bestrahlung ermöglicht, oder Behandlung mit niedermolekularen Inhibitoren).

Kritische Schritte in diesem Protokoll sind (i) die Verwendung von ausreichend DNAse, die erleichtert Zellsortierung durch die Vermeidung von Zellklumpen und Aggregate, und (ii) im Einklang Hoechst 33342 Färbung, die notwendig sind, um effizient zu unterscheiden die verschiedenen Populationen der meiotischen Phase-Zellen ist. Darüber hinaus sollten FACS Betreiber sich mit den Besonderheiten und Eigenarten der meiotischen cell sorting vertraut machen, um optimal Setup ihr Instrument, um die Profile in Abbildung 1 und in dem Video gezeigt zu erhalten. Eine mögliche Änderung könnte der Hoechst 33342 mit dem neuen Vybrant DyeCycle Violet Stain (Invitrogen), die für die violetten Laser optimiert wurde ersetzt. Allerdings wäre das Gesamtprofil nicht zu erwarten, drastisch verändern werden. Schließlich ist es auch wichtig zu beachten, dass aufgrund der Art des Gewebes verwendet werden, eine typische Vorgehensweise wird 1 ½ Std. zu nehmen, um die meiotischen Zellen und 4 bis 6-Stunden-Vorbereitung für die Zelle sortieren, plus zusätzliche post-sort-Manipulationen.

Materials

Collagenase Type-1	Worthington Biochemical	CLSS1	Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C
Trypsin	Worthington Biochemical	TRL3	Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C
H–chst 33342	Acros Organics	230001000	Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C
DNAse I	Sigma-Aldrich	DNEP	Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C
Gey’s Balance Salt Solution	Sigma-Aldrich	G9779
6" Transfer Pipet	Fisher Scientific	137119D