Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Zusammenfassung

Zerstörungsfreie Volumen-Visualisierung können nur von tomographischen Techniken, von denen die am effizientesten ist die x-ray micro-Computertomographie (CT) erreicht werden.

Zusammenfassung

Zerstörungsfreie Volumen-Visualisierung können nur von tomographischen Techniken, von denen die am effizientesten ist die x-ray micro-Computertomographie (μCT) erreicht werden.

Hochauflösende μCT ist ein sehr vielseitiges und doch präzise (1-2 Mikrometer-Auflösung)-Technik für 3D-Untersuchung der ex-vivo biologischen Proben ^{1, 2.} Im Gegensatz zu Elektronen-Tomographie Gegensatz ermöglicht die μCT die Prüfung von bis zu 4 cm dicken Proben. Diese Technik erfordert nur wenige Stunden nach der Messung bis Wochen in der Histologie verglichen. Darüber hinaus bedeutet μCT nicht auf 2D stereologic Modelle verlassen, so kann es zu ergänzen und in manchen Fällen sogar ersetzen histologischen Methoden ^{3, 4,} die sowohl zeitaufwendig als auch destruktiv sind. Probenaufbereitung und die Positionierung in μCT ist unkompliziert und erfordert keine hohen Vakuum oder niedrigen Temperaturen, die sich nachteilig auf die Struktur. Die Probe positioniert ist und um 180 ° oder 360 ° zwischen einem microfocused Röntgenquelle und einem Detektor, der einen Szintillator und eine genaue CCD-Kamera, für jeden Winkel eine 2D-Bild aufgenommen wird einschließt, und dann das gesamte Volumen rekonstruiert wird mit einem der verschiedenen zur Verfügung stehenden Algorithmen ^5-7. Die 3D-Auflösung steigt mit der Abnahme der Drehung Schritt. Die vorliegende Video-Protokoll zeigt die wichtigsten Schritte in Vorbereitung, Immobilisierung und Positionierung der Probe durch bildgebende bei hoher Auflösung an.

Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. Nach dem Entpacken des Gewebes, das untersucht werden soll, kann mineralisierten Geweben in das Instrument positioniert und abgebildet. Um das Bild mit der Maus Femur sollte man die folgenden Schritte:
   1. Entfernen post mortem Bein von einem C57/BL6 Embryo 18,5 Tage postceutus (E18.5).
   2. Seal das schmale Ende einer Polystyrol-Pipettenspitze (20-200 ul) mit Epoxidharz oder einem anderen Kleber, und füllen Sie die Spitze mit dem Arbeitstitel Puffer (PBS oder andere).
   3. Fit eng am Bein in die Spitze und Dichtung am anderen Ende mit Parafilm Blatt.
   4. Setzen Sie die Pipettenspitze in einer geeigneten Halterung und folgen Sie dem Protokoll aus Kapitel 3. Zur Visualisierung der Oberschenkelknochen aus der Maus Bein Embryo, ist das Instrument 40 KV und 200 uA gesetzt. Für 8μ Auflösung 1000 Projektion von Bildern mit 4x Vergrößerung müssen erworben werden.
2. Non-mineralisierten Geweben müssen zunächst fixiert und gefärbt, um die X-ray Abschwächung der Gewebe von Interesse, indem Sie eines der vielen verfügbaren Protokolle ^8,9 zu erhöhen. Für die Rattenlungen und ähnliche Proben, ist die Vorbereitung Protokoll:
   1. Orthotopical Implantation von nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) NCI-H460 auf nude Rattenlungen
   2. Lungenkrebs Knötchen beginnen nachweisbar ist 4 Wochen nach der Implantation
   3. Sacrifice der Ratte und sofort ziehen es mit Kochsalzlösung mit Heparin gemischt
   4. Inject es mit einer verdünnten Lösung von Microfil (Flowtech), (2 ml der Verbindung Lösung, 3 ml Verdünnungsmittel und 0,3 ml Härter) in die linke Herzkammer, die bronchiale Zirkulation Fleck
   5. Entpacken Sie die Lungen und das Herz der Ratte
   6. Immobilisierung der Probe (siehe Kapitel 2 des Protokolls) durch den Einbau ihn fest in ein 50 ml Plastikröhrchen
   7. Erstellen Sie einen gesättigten Ethanol Atmosphäre, indem Sie auf den Boden des Röhrchens ein Tuch in Ethanol gedämpft
   8. Kleben oder schrauben das Rohr in einer Halterung des Instruments
   9. Fahren Sie mit der Einstellung der Aufnahmeparameter (Kapitel 3). Für eine vollständige Darstellung der Rattenlungen der Quelle bei 40KV und 100 uA gesetzt. Um 16μ Auflösung zu erreichen hat man bis 2500 Projektionsbilder bei einer Vergrößerung von 0.5x zu erwerben.

2. Beispiel Immobilisierung

Bei hoher Auflösung, ist es wichtig, jede Veränderung in der Probe Position während der Messung zu vermeiden. Dazu wird die Probe fest in einem Kunststoff-Empfänger, dass seine Größe passt fixiert. Polystyrol Pipettenspitzen, Kunststoff Pasteur Pipetten oder eigens dafür gebauten Kunststoff-Halter sind in diesem Zusammenhang verwendet. Nach den experimentellen Anforderungen, kann die Probe in Luft untersucht werden oder eingetaucht in Ethanol oder Pufferlösungen. Typische Immobilisierung und endgültige Positionierung des Beines der Maus-Embryo in das Instrument ist in Abb. 1 dargestellt.

Abbildung 1. Endgültige Positionierung der embryonalen Maus Bein in der Mikro-CT Gerät.

3. Einstellen Aufnahmeparameter: x-ray von Spannung und Strom, CCD-Belichtungszeit

1. Platziert in eine Halterung, wird die Probe in die Rotation der Bühne des Instrumentes gelegt
2. Ein erstes Röntgenbild wird mit der Spannung und Strom willkürlich genommen.
3. Wenn das Bild zu dunkel ist, sollte man die Anzahl der Photonen ersten Anstieg, so erhöht ein wenig den Strom. Ist dies nicht genug ist, sollte man leicht erhöhen die Energie der Röntgenphotonen, dh die Spannung an der Röntgenröhre.
4. Wenn das Bild zu hell ist, sollte man zuerst die Spannung zu verringern, wird der aktuelle.
5. Die Helligkeit des Bildes kann durch Binning erhöht werden. Binning von 1 berücksichtigt die Intensität der einzelnen Pixel des Bildes, während Binning von 2 nimmt die Summe der einzelnen Matrix von 2x2 Pixeln. Das Bild wird ca. 4 mal heller als im Fall von Binning 1, aber die Hälfte der Auflösung haben.
6. Nach der Einstellung der optimalen Helligkeit, muss man die Belichtungszeit der Kamera, um zwischen den besten Kontrast auf der einen Seite und einer angemessenen Dauer des Experiments auf der anderen Seite Kompromiss zu optimieren.
7. Der Kontrast der Bilder, vor allem der geringe absorbierende Proben können mit Hilfe von Filtern, die die Photonenfluss zu reduzieren, vor allem, dass der Photonen von niedrigerer Energie verbessert werden.

4. Probenpositionierung

1. Wählen Sie die Arbeit Vergrößerung. Mögliche Optionen sind 0.5x, 4x, 10x, 20x und 40x. Das Sichtfeld nimmt mit zunehmender Vergrößerung.
2. Holen Sie sich die optimale Auflösung und Blickfeld, indem Sie die Abstände zwischen den Röntgenquelle und die Probe und zwischen der Probe und dem Detektor. Die Erhöhung der Quelle bis Probe-Abstand verringert sich das Sichtfeld und die Auflösung erhöht. Probe-Detektor-Abstand hat den gegenteiligen Effekt.

Das ganze Feld in 3D betrachtet werden sollte in denProjektionsbild bei allen Winkeln. Man sollte dies durch Rotation der Probe unter verschiedenen Winkeln und indem man die Probe so nah wie möglich auf die Drehachse zu überprüfen. Dazu sollte man die folgenden Schritte:

3. Nehmen Sie ein Bild bei 0 Grad, und drehen Sie dann die Probe bei -20 Grad. Wenn die gewünschte Lautstärke seitlich verschoben hat, sollte man seine Position durch Neupositionierung der Rotationsachse zu korrigieren.
4. Nach der Korrektur wird die Probe gedreht werden in einem anderen Winkel und die Position korrigiert erneut, bis das Feld von Interesse ist innerhalb des Bildes in allen Winkeln von -90 bis 90 Grad.

5. Hochauflösende Tomogramm

1. Während der Messung wird die Probe gedreht um einen kleinen Winkel zu einer Zeit und an jedem Winkel einen Vorsprung Bild aufgenommen wird. Die Gesamtzahl der Bilder ist immer ein Kompromiss zwischen der gewünschten Auflösung auf der einen Seite und der Zeitpunkt der Messung und die Größe der Datei auf der anderen Seite. Wie in Abb. 2 dargestellt, enthält jede einzelne Projektion alle Scheiben in der Probe überlagert einer über den anderen, und kann daher nicht erkennen die 3D-Struktur der Probe.

Abbildung 2. Projection Bilder der Lunge von Ratten bei 0 ° (A), 45 ° (B) und 90 ° (C) Drehwinkel.

2. Nur nach der Einnahme von Projektionsbilder mindestens zwischen -90 und 90 Grad, kann man auf die Rekonstruktion des Probenvolumens gehen. Wiederaufbau dauert zwischen 10 min und 2 Stunden, je nach der verwendeten Software und der Anzahl der Projektionen. Auch hier ist die endgültige Qualität des 3D-Bildes ein Kompromiss zwischen der gewünschten Auflösung und die Zeit will man ausgeben und die Größe der resultierenden Datei.

6. Abbildungsmaßstab Kalibrierung

Die Pixel-Ebene (Wert) in einem rekonstruierten Bild ist einzigartig für dieses Bild. Um zwei unterschiedliche Bilder zu vergleichen, hat eine einzigartige Intensität Skala auf jedem Bild verhängt werden. Aus diesem

1. Führen Sie einen Tomographie mit einem Standard-Phantom mit den gleichen experimentellen Bedingungen wie für die Probe
2. Kalibrieren Sie den Beispiel-Bild anhand der Werte für das Phantom erhalten. Die häufigsten Skala ist die Hounsfield (oder CT)-Skala. Für 4-fache Vergrößerung Hintergrund Wert von 15.000 (für Wasser oder PBS) wurde mit 0 ersetzt und der maximale Wert von 35.000 für die Knochen wurde mit dem Standard Hounsfield Wert von 3000 ersetzt. Andere Pixelwerte resultierte aus linearen Interpolation oder Extrapolation auf der Grundlage dieser Grenzen.

7. Bildverarbeitung und-analyse

Nach Erhalt Bilder mit hoher Auflösung, muss man zu den relevanten Informationen mittels Bildanalyse-Software zu extrahieren. Das Software-Paket verwendet werden muss, um für den Einsatz mit sehr großen Dateien (bis zu 20GB) zu arbeiten.

8. Repräsentative Ergebnisse

Eine Darstellung eines Oberschenkelknochens eines C57/BL6 Maus am Embryonaltag 18,5 (E18.5) - Vier Tage nach dem Beginn der Mineralisierung ist in Abb. 3 dargestellt. Die mineralischen Schichten sind deutlich sichtbar (weiß), während Weichteile nicht sichtbar sind in diesem Präparat. Wir Rund 1000 Projektion von Bildern mit einer linearen Vergrößerung von 4x. Die endgültige Auflösung beträgt 8 Mikrometer. Eine sorgfältige Analyse der Volumen-Rendering in Abb.1 dargestellt, zeigt, dass die Knochen Volumenanteil (der Anteil des Knochens Volumen, das von mineralisiertem Gewebe besetzt ist) 0,18 ist, und die Knochendichte ist 723 mg / cm ^3. Diese Werte ermöglichen es uns, diese Struktur mit Knochen vergleichen in anderen Stadien der Entwicklung.

Abbildung 3. Verschiedene Darstellungen eines 3D-Bildes einer Maus Femur Embryo. Die transversale (Querschnitt) (A), sind die sagittale (medio-lateral) Abschnitt (B) und eine Momentaufnahme des Volume-Rendering (C) gezeigt.

Abbildung 4 zeigt ein 3D-Bild der Lunge eines weiblichen Aktes Ratte (RNU), 12 Wochen alt, orthotop mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) NCI-H460 implantiert. 2500 Projektion Bilder wurden mit einer linearen Vergrößerung von 0,5 x genommen, wodurch eine endgültige Auflösung von 16 Mikrometern. Das Bild zeigt die Microfil gefärbten Blutgefäße (bis zu 20 Mikrometer Durchmesser). Das Bild Analyse zeigt, dass 4 Wochen nach der Implantation, multiple Krebsknoten bilden. Sie decken einen erheblichen Teil der Lungenvolumen (17%). Die meisten der pulmonalen Färbung wurde in den Randbereichen der Tumoren gefunden. Deutlich, wie in der Figur 4B gezeigt, sind mehrere Blutgefäße derzeit auch innerhalb der Knötchen, Abdecken, nach vorläufigen Analyse etwa 3% ihres Volumens.

Abbildung 4. 3D-Bild von Krebs Knötchen wächst in eine RatteLunge. Eine Momentaufnahme des Volume-Rendering (A) und einen Schnitt durch das Volumen (B) werden gezeigt. Der Krebs Knötchen sind mit Pfeilen markiert.

Movie 1. Volume Rendering der Maus Femur in Abbildung 1. Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.

Movie 2. Volume Rendering der Rattenlungen in Abbildung 2. Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.

Movie 3. Serienschnitte durch die Lungen. Die Knoten erscheinen als graue Flächen in den meisten Scheiben schneiden. Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.

Diskussion

C57/BL6 Maus am Embryonaltag 18,5 (E18.5) ist vier Tage nach dem Beginn der Mineralisierung. In diesem Stadium der Entwicklung, ist die Zukunft Knochen aus vielen Schichten der mineralisierten Osteoid gemacht, klar in Abb. 3 zu sehen. An dieser Stelle sollte man betonen, dass mineralisierten Geweben bei geringerer Auflösung visualisiert werden können mit verschiedenen Instrumenten, die weniger Probenhandling erfordern. Das vorliegende Protokoll (und der Mikro-CT Gerät in ihr verwendet) neben der Bereitstellung höherer Auflösung, bietet höchste Flexibilität für den Benutzer zu den besten geometrischen Parameter für die Messung auswählen.

Ergebnisse in Abb. 4 zeigen, dass in der orthotopen Lungenkrebs Tiermodellen menschlichen nicht-kleinzelligem Lungenkrebs kann Rekrutierung von Blutgefäßen und Gefäßneubildung zu induzieren. Wir denken, dass das Lungengewebe weder verschoben wurde, noch hat seine Form verändert während der Messung. Der Benutzer sollte besondere Vorsichtsmaßnahmen ergreifen, um solche Veränderungen während einer Tomographie zu vermeiden. Bei einigen Proben, insbesondere für die weichere Gewebe, muss man spezielle Haltevorrichtungen, die perfekt die Probe während der Messung zu immobilisieren zu bauen. Leider ist die Anwesenheit von hohen Leckagen von Kontrastmittel in der Umgebung des Tumors verhindert zuverlässige Quantifizierung der peripheren Blutgefäße. Als Ergebnis werden die Bilder von einigen Färbemittel insbesondere an den Rändern verdorben, was eindeutig in Filmen 2 und 3. Wir konnten dies nicht verhindern verschütten, sondern der nützliche Informationen über die Krebsknoten, einschließlich ihrer Größe, Form und das Vorhandensein von inneren Blutgefäße wurde nicht beeinträchtigt. Wir konnten deutlich feststellen, dass zumindest für die bronchiale Zirkulation, die hier untersucht wurde, periphere Durchblutung in Tumorperfusion beteiligt ist, mit einigen Perfusion präsentieren auch im Inneren des Tumors.

Materialien

Für Bildaufnahme haben wir ein MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographischen Systems durch Xradia, Concord, USA, hergestellt werden.

Die Bilder wurden bearbeitet und analysiert mit ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, Frankreich) und MicroView (General Electric, USA) Software-Pakete. Alle verfügbaren Bildanalyse-Software kann ebenfalls verwendet werden,