Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Zusammenfassung

Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie (OR-PAM) ist eine aufstrebende Technologie, mit der abbildenden optischen Absorption Kontraste In vivo Mit zellulärer Auflösung und Empfindlichkeit. Hier bieten wir eine visualisierte Anweisungen auf dem experimentellen Protokolle der OR-PAM, einschließlich der System-Konfiguration, System-Ausrichtung, typisch In vivo Experimentellen Verfahren und der funktionellen Bildgebung Systeme.

Zusammenfassung

Optische Mikroskopie und bietet wertvolle Einblicke in die zellulären und Organellen Ebenen, wurde vielfach als ein förderliches biomedizinische Technologie anerkannt. Da die tragenden Säulen in vivo dreidimensionale (3-D) Lichtmikroskopie, single-/multi-photon Fluoreszenzmikroskopie und optische Kohärenztomographie (OCT) haben ihre außergewöhnliche Sensibilität für Fluoreszenz-und optische Streuung Kontraste zeigen, jeweils. Allerdings hat die optische Absorption dagegen von biologischen Geweben, die wesentliche physiologische / pathologische Angaben kodiert, noch nicht abschätzbar gewesen.

Die Entstehung der biomedizinischen Photoakustik hat zu einem neuen Zweig der optischen Mikroskopie optische Auflösung photoakustische Mikroskopie (OR-PAM) ^1, wo die optische Strahlung, die Beugungsgrenze fokussiert wird, um zelluläre ¹ oder sogar subzelluläre Ebene ² laterale Auflösung zu erreichen geführt. Als wertvolle Ergänzung zu den bestehenden optischen Mikroskopie-Technologien, bringt OR-PAM in mindestens zwei Neuheiten. Zuerst und vor allem erkennt OR-PAM optische Absorption kontrastiert mit außergewöhnlichen Empfindlichkeit (dh 100%). Kombinieren oder-PAM mit Fluoreszenzmikroskopie ³ oder mit optisch-Streuung basierenden ^{4. Oktober} (oder mit beiden) bietet umfassende optischen Eigenschaften von biologischen Geweben. Zweitens kodiert OR-PAM optische Absorption in akustische Wellen, im Gegensatz zu den reinen optischen Verfahren in der Fluoreszenzmikroskopie und OCT, und bietet Hintergrundinformationen Detektion. Die akustische Detektion in OR-PAM mildert die Auswirkungen der optischen Streuung an Signalverschlechterung und natürlich eliminiert mögliche Störungen (dh, Übersprechen) zwischen Anregung und Detektion, die ein häufiges Problem in der Fluoreszenzmikroskopie aufgrund der Überschneidungen zwischen den Anregungs-und Fluoreszenz-Spektren.

Einzigartig für optische Absorption Imaging, hat OR-PAM breiten biomedizinischen Anwendungen seit seiner Erfindung, einschließlich nachgewiesen, aber nicht, Neurologie ^{5, 6,} Augenheilkunde ^{7, 8,} vaskuläre Biologie ⁹ und Dermatologie ¹⁰ begrenzt. In diesem Video, lehren wir die Systemkonfiguration und die Ausrichtung der OR-PAM sowie die experimentellen Verfahren für in vivo funktionelle mikrovaskuläre Bildgebung.

Protokoll

1. System-Konfiguration

1. Optische Strahlung
   1. Optische Strahlungsquelle: einen diodengepumpten Festkörperlaser gepulsten Lasers (INNOSLAB, EdgeWave) und einem Farbstofflaser (CBR-D, Sirah).
   2. Die Ausgangs-Laserstrahl (Impulsdauer: 7 ns) wird durch eine Kondensorlinse (LA1131, Thorlabs) durch eine 50-um Pinhole-Pass (P50C, Thorlabs) fokussiert.
   3. Die Lochkamera ist ein wenig weg vom Fokus der Kondensorlinse positioniert, um den Durchmesser der Blende mit der fundamental-mode Strahldurchmesser für die effektive räumliche Filterung entsprechen.
   4. Die gefilterte Strahl wird gedämpft durch eine neutrale Dichte Filter (NDC-50C-2M, Thorlabs) und dann in eine Single-Mode-Glasfaser (P1-460A-FC-2, Thorlabs) gekoppelt.
   5. Die Faser-Ausgang füllt den Rücken Öffnung eines Mikroskop-Objektivs (RMS4X, Thorlabs) zu einem beugungsbegrenzten optischen Mittelpunkt ~ 2,6 um bei der Wellenlänge von 570 nm zu erreichen.
2. Ultraschall-Erkennung
   1. Ultraschallwandler: 50-MHz Mittenfrequenz (V214-BB-RM, Olympus-NDT).
   2. Der Ultraschallwandler ist es, eine hausgemachte akustisch-optischen Strahl-Kombinierer ¹¹ für Ultraschall-Erkennung, die koaxial mit der beugungsbegrenzten optischen Strahlung ausgerichtet befestigt.
   3. Ein kugelförmiger Hohlraum ist von der Unterseite der Kombinierer Boden zu einer akustischen Linse zu produzieren. Diese akustische Linse hat eine numerische Apertur von 0,5 in Wasser und gibt ein akustisches Fokusdurchmesser von 43 um an der 50-MHz Mittenfrequenz.
   4. Die optische und akustische Schwerpunkte sind konfokal die Nachweisempfindlichkeit zu maximieren ausgerichtet.
3. Acoustic-Kopplung
   1. Trockene Ultraschall-Ankopplung verwendet wird, um zu vermeiden Eintauchen Versuchstieren in Wasser, das war in der frühen photoakustische Imaging-Systeme ¹² verwendet.
   2. Ein bildgebendes Fenster in den Boden einer Petrischale (9 cm im Durchmesser) eröffnet und ist mit einem Ultraschall-und optisch transparenten Polyethylen-Membran verschlossen.
   3. Ultraschall-Gel (Clear Image, SonoTech) zwischen dem Polyethylen-Membran und dem abzubildenden Objekt koppelt die erzeugten photoakustischen Welle aus dem Objekt in die Petrischale, und VE-Wasser in der Petrischale weitere Paare die Welle auf die Wasseroberfläche oder-PAM Bildgebung Kopf .
4. Elektronik
   1. Das PA-Signal von dem Ultraschallwandler detektiert wird durch zwei kaskadierte Verstärker (ZFL 500LN, Mini-Circuits) verstärkt
   2. Das verstärkte Signal wird durch einen 14-Bit-Datenerfassungssystem (DAQ) board (CompuScope 14200, Gage Applied Sciences) mit einer Abtastrate von 200 MS / s. digitalisiert
5. Scanning System
   1. Zweidimensionale (2-D) Rastern der OR-PAM Imaging-Kopf entlang der horizontalen (xy)-Ebene wird durch einen Personal-Computer, der sowohl die DAQ-Karte und der Pump-Laser löst gesteuert. Die Trigger-Signal wird mit dem Takt-out-Signal von der DAQ-Karte synchronisiert.
   2. Die schnelle Achse der 2-D-Scanner ist die Richtung des Querschnitts-Scan (B-Scan) definiert.
   3. Eine Folge von B-Scan-Bilder können durch die Übersetzung der Imaging-Kopf entlang der langsamen Achse, um eine volumetrische Bild, das entweder in einem direkten 3-D-Rendering oder in einem 2-D-Projektion maximale Amplitude (MAP) Bild betrachtet werden Form erworben werden .

2. System Ausrichtung

1. Verwenden Sie Impuls-Echo-Ultraschall und Ultraschall-Reflektor, um die Position der akustischen Brennebene (dh die Zeitverzögerung vom Triggersignal, um die maximale Puls-Echo-Ultraschall-Signal) zu bestimmen. Dieser Schritt ist erforderlich, um nur einmal durchgeführt werden beim Bau der OR-PAM-System.
2. Maximieren Sie die Kopplungseffizienz der Singlemode-Faser.
3. Bewerben Ultraschall-Gel auf einer optisch absorbierenden Gegenstand (z. B. ein Stück schwarzes Klebeband) und befestigen Sie es sanft unter den bildgebenden Fenster in der Petrischale mit deionisiertem Wasser gefüllt.
4. Senken Sie die Imaging-Kopf ins Wasser, und entfernen Sie Luftblasen unter der akustischen Linse eingefangen.
5. Passen Sie die Imaging-Kopf, bis das photoakustische Signal der absorbierenden Objekt wird aus der akustischen Brennebene, die von der akustischen Verzögerung beurteilt werden können.
6. Stellen Sie die vertikale Position (dh, z-Position) des Mikroskop-Objektivs um die Amplitude der photoakustische Signal aus dem flachen Gegenstand erzeugt maximieren. Die maximale Signalamplitude lässt vermuten, dass der optische Schwerpunkt mit den akustischen Mittelpunkt in vertikaler Richtung ausgerichtet ist.
7. Passen Sie die horizontale Position (dh, x-und y-Positionen) des Mikroskop-Objektivs, bis das photoakustische Signal aus dem Ziel generiert zeigt ein symmetrisches Muster. Die Symmetrie lässt vermuten, dass der optische Schwerpunkt mit den akustischen Mittelpunkt in horizontaler Richtung ausgerichtet ist.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2,6 und 2,7, bis die photoakustische Signal in beiden Symmetrie und Amplitude optimiert ist.

3. A sa mple experimentelle Verfahren in vivo OR-PAM von Mausohr Gefäßsystem

1. Dieser Schritt ist nicht für Nacktmäuse erforderlich. Anesthetize das Tier mit einer intraperitonealen Injektion eines Cocktails [Rezept: 1 ml Ketamin (100 mg / ml), 0,1 ml Xylazin (100 mg / ml) und 8,9 ml Kochsalzlösung, Dosierung: 0,1 ml/10 g]. Shave die Haare im Ohr, und weitere enthaaren das restliche Haar mit Surgi Cream (Kategorie #: 82565, American International Industries) vor der Reinigung mit destilliertem Wasser. Beachten Sie, dass solche Enthaarung könnte leicht die Haut reizen Gefäßsystem und ist somit am besten 24 Stunden vor dem geplanten Experiment durchgeführt.
2. Schalten Sie den photoakustischen Laser-System, und überprüfen Sie die Ausrichtung des Systems.
3. Anesthetize die Maus mit 3% Isofluran durch die Inhalation Gas (die typischen Durchfluss beträgt 1,0-1,5 l / min, je nach Tierart Körpergewicht) verdampft und Aufrechterhaltung der Narkose mit 1% Isofluran während des gesamten Experiments. Medical-Grade-Luft als das Einatmen Gas, um die Maus bei normalen physiologischen Zustand zu erhalten empfohlen.
4. Übertragen Sie die Maus auf eine stereotaktische Bühne und steuern ihre Körpertemperatur auf 37 ° C mit einem Heizkissen.
5. Glätten Sie die Maus Ohr auf einer Kunststoffplatte und eine Schicht Ultraschall-Gel auf dem Ohr. Vermeiden Sie Lufteinschlüsse im Inneren des Gels. Legen Sie dann das Ohr unter der bildgebenden Fenster und langsam erhöhen das Tier Bühne, bis der Ultraschall-Gel in Kontakt mit der Unterseite des Polyethylen-Membran. Weiche ist erforderlich, weil Sie die Ohr an die Membran kann den Blutfluss im Ohr beeinflussen.
6. Clamp ein Pulsoximeter, um die Maus Bein oder Schwanz, um ihre physiologischen Status zu überwachen, und wenden Salbe auf die Augen zu Trockenheit und der zufälligen Laser Schäden an der Maus Augenkontakt zu vermeiden.
7. Senken Sie die Imaging-Kopf, bis der akustischen Linse in VE-Wasser eingetaucht wird, und entfernen Sie Luftblasen unter der akustischen Linse eingefangen.
8. Überprüfen Sie die Laserfluenz um sicherzustellen, dass es innerhalb der Laser-Sicherheitsstandards des American National Standards Institute ^13. Die Laserfluenz sollte nicht mehr als 20 mJ / cm ^2, die in 80 nJ von Laserpulsenergie, wenn der Laserstrahl auf 150 pm unter der Hautoberfläche fokussiert übersetzt.
9. Stellen Sie den Laser auf die externen Trigger-Modus und starten Studie Scannen. Stellen Sie die z-Position des Imaging-Kopf, bis die stärkste photoakustische Signal wird von der akustischen Brennebene.
10. Richtige Scan-Parameter und starten formalen Bildaufnahme.
11. Nach dem Experiment, schalten Sie den Laser, heben Sie den Imaging-Kopf aus dem VE-Wasser, niedere Tier Bühne, um die Maustaste loslassen, reinigen Sie die Maus Ohr mit VE-Wasser, schalten Sie den Anästhesie-System und die Temperatur-Controller, und entladen Sie die Maus aus der stereotaktischen Bühne.
12. Wenn sich wiederholende Bildgebung erforderlich ist, legen Sie die Maus in einem Inkubator mit der Umgebungstemperatur bei 37 ° C eingestellt Bringen Sie die Maus an die Tierhaltung, nachdem er aufwacht natürlich. Andernfalls folgen Sie den Tier-Protokolle euthanatize und entsorgen Sie es.

4. Funktions-oder-PAM von Gesamt-Konzentration und der Sauerstoffsättigung des Hämoglobins

1. Oxyhämoglobin (HBO ₂₎ und Desoxyhämoglobin (HbR) sind die beiden wichtigsten Formen von Hämoglobin, das vorherrschende endogenen photoakustische Quelle im sichtbaren Spektralbereich. HbO ₂ und HbR haben unterschiedliche optische Absorptionsspektren und können somit spektral differenziert werden, um sowohl die Gesamt-Konzentration (HBT) und Sauerstoffsättigung (SO ₂₎ von Hämoglobin ⁵ quantifizieren. Hier sind zwei Richtlinien, um wählen Sie das richtige optische Wellenlängen für die SO _2-Messungen:
2. Wellenlängen sollte innerhalb der Q-Bande des Hämoglobin-Absorptionsspektrum (dh 550-600 nm) ausgewählt werden, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis und eine ausreichende Marktdurchdringung zu gewährleisten.
3. Wellenlängen, bei denen die Absorptionskoeffizienten von HBO ₂ und HbR haben einen ausgeprägten Unterschied (zB HBr-dominant 561 nm und HbO _2-dominant 578 nm) empfohlen.

Neben SO _2, kann HBT indem berechnet werden [HBr] und [HbO _2] zusammen, oder es kann direkt am isosbestischen Wellenlängen des molaren Extinktionskoeffizienten-Spektren von Hämoglobin (zB 530 nm, 545 nm, 570 nm und gemessen werden 584 nm) ^14, wo HBr und HbO ₂ haben den gleichen molaren Extinktionskoeffizienten.

5. Repräsentative Ergebnisse:

In Abbildung 1 ist die vaskuläre Anatomie und SO ₂ in einem lebenden Nacktmaus Ohr durch zwei Wellenlängen (561 und 570 nm) OR-PAM abgebildet. Die typische Bildaufnahme Zeit für Zwei-Wellenlängen-sO ₂ Messungen einer solchen Region of Interest (Bildgröße: 10 mm x 10 mm; Schrittweite: 2,5 mu m x 5 um) ~ 80 min.

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Abbildung 1. In vivo optische Auflösung photoakustische Mikroskopie. MAP Bilder von (A) die totale Hämoglobinkonzentration, die die vaskuläre Anatomie (erworben bei 570 nm) und (B) die Sauerstoffsättigung des Hämoglobins (erworben bei 561 nm und 570 nm) in einer Nacktmaus Ohr. (C) Close-up der boxed Region in Panel (A). Der Maßstab in Panel (A) gilt für beide (A) und (B).

Diskussion

In diesem Video stellen wir eine ausführliche Anleitung über die experimentelle Protokolle der OR-PAM, einschließlich der System-Konfiguration, System-Ausrichtung und typischen experimentellen Verfahren. Label-freie, nicht-invasive OP-PAM hat Studien der mikrovaskulären Funktion und Stoffwechsel auf einer einzigen Kapillare Basis aktiviert und hält dadurch das Potential, unser Verständnis der Mikrozirkulation im Zusammenhang mit der Physiologie und Pathologie zu erweitern. Microphotoacoustics ist derzeit Herstellung die...

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