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Methodenartikel

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

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DOI:

10.3791/2813

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16. Juli 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Ex vivo Protokoll zur Erzeugung reifen menschlichen roten Blutkörperchen aus hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen beschrieben. Zusätzlich beschreiben wir eine effiziente lentivirale-Delivery-Methode Knockdown des Transkriptionsfaktors TAL1 in primären erythroiden Zellen. Die Effizienz der Lentivirus vermittelten Gentransfer nachgewiesen wird, mit GFP-exprimierenden Viren.

Zusammenfassung

Erythropoese ist eine häufig verwendete Modellsystem zur Untersuchung der Zelldifferenzierung. Während Erythropoese, pluripotenten adulten humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) in oligopotent Vorfahren, engagiert Vorläufern und reifen roten Blutkörperchen Zellen 1 zu unterscheiden. Dieser Prozess ist für einen großen Teil auf der Ebene der Genexpression, wobei spezifische Transkriptionsfaktoren aktivieren Linie-spezifischer Gene reguliert, während gleichzeitig unterdrücken Genen, die spezifisch für andere Zelltypen 2 sind. Studien über Transkriptionsfaktoren regulieren Erythropoese sind oft unter Verwendung von humanen und murinen Zelllinien, stellen zum Teil erythroiden Zellen zu bestimmten Stadien der Differenzierung 3-5. Allerdings transformierten Zelllinien nur teilweise imitieren erythroiden Zellen und vor allem sie nicht erlauben es, nachvollziehbar Studie der dynamischen Veränderungen, die als Zellen des Fortschritts ist möglich durch viele Stadien zu ihrer endgültigen erythroiden Schicksal. Somit bleibt eine aktuelle Herausforderung der Entwicklung eines Protokolls zu relativ homogenen Populationen von primären HSC und erythroiden Zellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung zu erhalten, die in Mengen, die ausreichen, Genomik und Proteomik Experimente durchzuführen sind.

Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Zellkultur-Protokoll zu erythroiden Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen, die aus entweder Nabelschnurblut, Knochenmark oder dem peripheren Blut Erwachsener mit G-CSF (Leukapherese) mobilisiert wurden, isoliert zu induzieren. Diese Kultur zeichnet sich anfänglich durch die Douay Labor 6 entwickelt, nutzt Zytokine und Co-Kultur auf mesenchymale Zellen in die Knochenmark-Mikroumgebung nachahmen. Mit dieser ex vivo Differenzierung Protokoll, beobachten wir eine starke Verstärkung von erythroiden Vorläuferzellen, eine Induktion der Differenzierung ausschließlich auf die erythroiden Linie und eine vollständige Reifung auf der Bühne des entkernten roten Blutkörperchen. So bietet dieses System die Möglichkeit, den molekularen Mechanismus der Regulation der Transkription als hämatopoetische Stammzellen Fortschritte auf dem erythroiden Linie zu studieren.

Studieren Erythropoese auf der Transkriptionsebene erfordert auch die Fähigkeit, über-express oder Knockdown spezifische Faktoren in primären erythroiden Zellen. Zu diesem Zweck verwenden wir ein Lentivirus-vermittelte Gentransfer-System, das für die effiziente Infektion von beiden Teilen und nicht teilende Zellen 7 ermöglicht. Hier zeigen wir, dass wir in der Lage, effizient Knockdown des Transkriptionsfaktors TAL1 in primären humanen erythroiden Zellen sind. Darüber hinaus zeigt die GFP-Expression mit einem Wirkungsgrad von lentiviralen Infektion fast 90%. So bietet unser Protokoll ein sehr nützliches System für die Charakterisierung des regulatorischen Netzwerkes von Transkriptionsfaktoren, die Steuerung der Erythropoese.

Protokoll

Teil I. ex vivo-Erythropoese menschlicher hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen

1. Isolierung von CD34+ humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

Die humane CD34+-Zellpopulation, die eine Mischung aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und frühen Vorläuferzellen enthält8, wird aus Nabelschnurblut, aus mit G-CSF mobilisiertem peripherem Blut (Leukapherese) oder aus Knochenmark gewonnen (Abbildung 1 – Schritt 1). Wenn Nabelschnurblut oder peripheres Blut verwendet wird, fahren Sie direkt mit Schritt 1.2 fort. Bei Verwendung von Knochenmark beginnen Sie mit Schritt 1.1. Für Reagenzien und Geräte siehe Tabelle 1.

Dieser Schritt wird unter sterilen Bedingungen (d. h. im Sicherheitswerkbank) und bei RT durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

  1. Herstellung einer Einzelzell-Suspension aus Knochenmark:
    1. Resuspendieren Sie das Mark in 10 Vol. RPMI 1640, das 0,02 % Kollagenase B und 100 U/ml DNase 1 enthält.
    2. Sanft 45 Minuten lang auf einem Balancier-Shaker mischen.
    3. Filtern Sie die Zellen durch eine Nylon-Membran mit 30 μm Porengröße.
  2. Isolieren Sie mononukleäre Zellen mit geringer Dichte (MNCs) durch Zentrifugation über eine Ficoll-Dichtegradienten:
    1. Blut- oder Knochenmarkssuspension mit 2–4 Vol. PBS, der 2 % fetales Kalfserum (FBS) und 2 mM EDTA enthält, verdünnen. Hinweis: Höhere Volumina erhöhen die Reinheit der mononukleären Zellen (MNCs).
    2. In einem 50-ml-Konischkolben vorsichtig 35 ml verdünnte Zellsuspension über 15 ml Ficoll-Paque schichten. 30 min bei 400g in einem Schwenkkorbrotor ohne Bremse zentrifugieren.
    3. Entfernen Sie die obere Schicht, wobei die darunterliegende intermediäre MNC-Schicht ungestört bleibt.
    4. Überführen Sie die Interphasenschicht (enthaltend MNCs) in ein neues 50-ml-Konischgefäß.
    5. Geben Sie PBS mit 2 % FBS und 2 mM EDTA hinzu, um das Röhrchen aufzufüllen, mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens und zentrifugieren Sie 10 min bei 300 g bei RT. Entsorgen Sie den Überstand.
    6. Waschen Sie das Zellpellet zwei weitere Male, um Thrombozyten zu entfernen. Hinweis: Dieser Schritt erhöht die Reinheit von CD34+ Zellen
    7. Nehmen Sie 20 μl Zellsuspension und geben Sie diese in ein Eppendorf-Röhrchen. Fügen Sie 200 μl Lysepuffer für rote Blutkörperchen (Tabelle 1) hinzu und inkubieren Sie 2 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie 18 μl dieser Suspension unter ein Hämozytometer und zählen Sie die kernhaltigen MNCs.
    8. MNCs können sofort verwendet oder bei 10 °C eingefroren werden8 Zelle/ml in Zellkulturmedium mit 10 % DMSO und Lagerung in flüssigem Stickstoff.
  3. CD34 isolieren+ Zellen durch positive immunmagnetische Selektion (Abbildung 1 – Schritt 1)
    Wir verwenden das CD34 Mikroperlen-Kit (enthält eine Lösung von Mikroperlen, konjugiert mit monoklonalen mausartigen humanen CD34-Antikörpern, und eine Lösung des FcR-Blockierreagens, das humanes IgG enthält) in Kombination mit zwei LS Mini-MACS-Säulen, dem autoMACS Laufpuffer und einem MiniMACS-Separator (Tabelle 1). Im Folgenden beschreiben wir unser Protokoll ausgehend von 2,3 × 108 MNCs. Wenn unterschiedliche Zellzahlen verwendet werden, sollten die Volumina entsprechend skaliert werden. Zusätzlich, für bis zu 2x108 MNCs a MS MiniMacs-Säule kann anstelle der LS MiniMacs-Säule verwendet werden.
    Halten Sie Zellen und Reagenzien kalt (4–8 °C), um eine Kapazitation von Antikörpern an der Zelloberfläche und eine unspezifische Zellmarkierung zu verhindern.
    1. Resuspendieren Sie das Pellet, das 2,3x10 enthält8 MNCs in 690 μl Puffer für die Durchflussmessung (300 μl pro 108 MNCs, wobei 300 μl das erforderliche Mindestvolumen der Aufschlämmung ist) einstellen und in ein 15-ml-Konischgefäß überführen.
    2. Fügen Sie 230 μl FcR-Blockier-Reagenz hinzu.
    3. Fügen Sie 230 μl der CD34 MicroBeads-Lösung hinzu.
    4. Gründlich von Hand mischen und 30 min bei 4 °C inkubieren.
    5. Die Zellen durch Zugabe von 10 ml Laufpuffer waschen und bei 300 g 10 min zentrifugieren.
    6. Entfernen Sie den Überstand vollständig.
    7. Resuspendieren Sie die Zellen in 1,2 ml Laufpuffer (verwenden Sie 0,5 ml Puffer pro 108 MNCs) Achtung: Vor der magnetischen Trennung ist es wichtig, eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Gegebenenfalls die Zellen durch ein Nylon-Netz mit 30 μm Porendurchmesser filtern, um Zellklumpen zu entfernen.
    8. Bereiten Sie die LS-Säule vor, indem Sie sie in das Magnetfeld eines MiniMACS-Separators stellen.
    9. Spülen Sie die Säule mit 3 ml Laufpuffer.
    10. Geben Sie 1,2 ml Zellsuspension auf die Säule.
    11. Sammeln Sie den Durchlauf und verwenden Sie ihn zur Überprüfung der Ausbeute und Reinheit der CD34+ Zellisolierung. Alternativ können die Zellen in diesem Fraktion einfrieren und in flüssigem Stickstoff lagern. Hinweis: Dieser Anteil enthält nicht markierte Zellen und kann außerdem einige markierte CD34+ Zellen, die nicht an die Säule gebunden haben.
    12. Spülen Sie die Säule dreimal mit jeweils 3 ml Laufpuffer, vereinigen Sie die Spüllösungen und verwenden Sie diese Fraktion entsprechend der Durchlauf-Fraktion oben.
    13. Entfernen Sie die Säule vom Magneten und stellen Sie sie auf ein 15-ml-Polypropylen-Sammelröhrchen.
    14. Zur Elution der Zellen 5 ml Laufpuffer auf die Säule geben und die markierten CD34-positiven Zellen sofort durchlaufen lassen+ Zellen durch festes Eindrücken des Kolbens in die Säule.
    15. Wiederholen Sie den Säulenaufreinigungsschritt (Schritte h bis n), indem Sie die Zellen über eine frisch präparierte LS-Säule leiten. Hinweis: Dies erhöht die Reinheit von CD34+ Zellen. Aus einer Suspension von 2,3x108 Aus aus Leukapherese isolierten MNCs erhalten wir typischerweise 1,1 × 106 CD34+ Zellen mit einer Reinheit > 95±3 % (Abbildung 1 – Schritt 1).
    16. Kryokonservieren Sie die Zellen in Kulturmedium mit 10 % DMSO und lagern Sie sie in flüssigem Stickstoff ein oder fahren Sie direkt mit Schritt 2) fort.

2. Erythroide Differenzierung in Zellkultur

CD34+-Zellen werden in supplementiertem IMDM-Medium mit sequenziellem Zusatz von Hydrocortison und spezifischen Kombinationen von Zytokinen gemäß einem aus vier Schritten bestehenden Protokoll, das von 6 adaptiert wurde (Abbildung 1 – Schritt 2), kultiviert. Während des gesamten Verfahrens werden eine Reihe von Tests durchgeführt, um das Zellwachstum und die erythroide Differenzierung zu überprüfen.

Die Anzahl an CD34+-Zellen, die zum Start einer Kultur erforderlich ist, variiert je nach Umfang des Experiments. Typischerweise führen wir für Genexpressionsstudien eine Kleinmaßstab-Kultur mit 0,1×106 CD34+-Zellen in 10 ml Medium durch und lagern im Verlauf des Verfahrens überschüssige Zellen durch Einfrieren ein, um die Volumina gering zu halten. Für Studien, bei denen eine Proteingewinnung erforderlich ist, werden Kulturen im größeren Maßstab durchgeführt. Hier beschreiben wir ein Experiment im großen Maßstab, bei dem wir mit etwa 7×106 aus Leukapherese isolierten CD34+-Zellen beginnen.
Während des gesamten Verfahrens werden sterile Bedingungen eingehalten. Für Reagenzien siehe Tabellen 1, 2 und 3.

  1. Zubereitung der Reagenzien
    1. Stellen Sie das supplementierte IMDM-Medium wie in Tabelle 2 beschrieben her und frieren Sie Aliquote von je 40 ml bei -20 °C ein (kann im Voraus erfolgen).
    2. Bereiten Sie Stammlösungen von Hydrocortison und Zytokinen wie in Tabelle 3 beschrieben vor.
  2. Schritt 1: Tag 0–11
    Hämatopoetische Zellen werden in supplementiertem IMDM-Medium mit Hydrocortison (HC), Stammzellfaktor (SCF), Interleukin 3 (IL-3) und Erythropoietin (EPO) (Tabelle 3) kultiviert. MS-5 murine Knochenmark-stromale Zellen (Tabelle 1) werden für Schritt 2 vorbereitet und vermehrt.
    • Tag 0:
      1. Erwärmen Sie 120 ml supplementiertes IMDM-Medium vor und geben Sie HC, SCF, IL-3 und EPO hinzu (Tabelle 3).
      2. Tauen Sie 7x106 CD34+-Zellen auf, indem Sie das Gefäß bzw. die Gefäße zunächst in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen. Während die Zellen noch gefroren sind, geben Sie 1 ml vorgewärmtes Medium hinzu und überführen die Zellen in ein 15-ml-Konischgefäß. Spülen Sie das Gefäß mit 2 ml Medium nach und überführen dies ebenfalls in das 15-ml-Gefäß.
      3. Geben Sie 6 ml Medium zur Zellsuspension hinzu, mischen Sie durch Umkippen des Gefäßes und zentrifugieren Sie bei 200 g für 5 min.
      4. Aspirieren Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml frischem Medium.
      5. Zählen Sie lebende Zellen mit einem Hämozytometer, nachdem Sie 10 μl Zellsuspension mit 10 μl Trypan-Blau-Lösung (Tabelle 1) vermischt haben. Hinweis: Die Zelltodrate beträgt beim Auftauen etwa 25 %, daher sollte die Konzentration an lebenden Zellen ~0,5x106 Zelle/ml betragen.
      6. Reservieren Sie etwa 3 ml Zellsuspension für Tests (siehe Absatz 6).
      7. Überführen Sie die verbleibenden 7 ml in einen T-175-Flasche und geben Sie 63 ml Medium hinzu, um eine Konzentration von 0,05x106 Zelle/ml in 70 ml zu erreichen, und stellen Sie die Flasche in einen Inkubator bei 37 °C.
    • Tag 1:
      1. Erwärmen Sie 85 ml MS-5-Zellkulturmedium vor: αMEM mit Glutamax (Tabelle 1), 10 % FBS sowie 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin.
      2. Bereiten Sie drei runde 150 mm x 25 mm Kulturschalen vor, die jeweils mit 2x106 MS-5-Zellen in 25 ml Medium beimpft werden, um eine Konzentration von 0,08x106 Zelle/ml zu erreichen, und stellen Sie sie in einen 37 °C-Inkubator. Hinweis: Beste Ergebnisse werden mit MS-5-Zellen niedriger Passage (<20) erzielt. Konfluente Kulturen sollten alle drei Tage durch Teilen im Verhältnis 1:5 unter Verwendung von Trypsin mit 0,05 % EDTA weitervermehrt werden.
    • Tag 2:
      1. Zählen Sie hämatopoetische Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderlichen Zellen (d. h. ~20 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Nach unserer Erfahrung kann die Zelltodrate in den ersten beiden Tagen 30–50 % überschreiten, sodass die endgültige Zellkonzentration gewöhnlich der am Tag 0 ähnelt (Abbildung 2).
      2. Ersetzen Sie das MS-5-Kulturmedium durch 25 ml frisches Medium, wobei sichergestellt werden muss, dass nicht angeheftete MS-5-Zellen entfernt werden.
    • Tag 4:
      1. Zählen Sie hämatopoetische Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderlichen Zellen (d. h. ~10 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt sollten sich die Zellen bereits vermehrt haben, mit >75 % lebenden Zellen bei einer Konzentration von ~0,2x106 Zelle/ml. Die Zellen können bei 1–2x106 Zelle/ml in supplementiertem IMDM-Medium mit 10 % DMSO eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
      2. Überführen Sie die verbleibenden ~40 ml Kultur in eine T-175-Flasche und geben Sie ausreichend supplementiertes IMDM-Medium mit HC, SCF, IL-3 und EPO (Tabelle 3) hinzu, um ein Endvolumen von 150 ml zu erreichen. Hinweis: Die Zellkonzentration sollte ~0,05x106 Zelle/ml betragen.
      3. Vermehren Sie die MS-5-Zellen (die 60–70 % konfluent sein sollten), indem Sie sie 1:5 in neue runde 150 mm x 25 mm Kulturschalen mit 0,05 % EDTA enthaltendem Trypsin verdünnen. Die endgültige Zellkonzentration sollte ~0,08x106 Zelle/ml betragen. Hinweis: Gewöhnlich kann eine Schale fünfmal erweitert werden, sodass Sie 15 Schalen mit MS-5-Zellen bei ~0,08x106 Zelle/ml erhalten sollten.
    • Tag 6:
      1. Zählen Sie hämatopoetische Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~5 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zellen befinden sich in einer stark proliferierenden Phase, und die Zellkonzentration sollte ≤1,5x106 Zelle/ml gehalten werden. Falls die Zellkonzentration höher ist, geben Sie frisches supplementiertes IMDM-Medium mit HC, SCF, IL-3 und EPO hinzu.
    • Tag 7:
      1. Zählen Sie hämatopoetische Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen. Hinweis: Nach unserer Erfahrung erreichen die Zellen am Tag 7 gewöhnlich eine Dichte von 1,5x106 Zelle/ml.
      2. Geben Sie ausreichend Medium hinzu, um eine Zellkonzentration von ~0,8x106 Zelle/ml aufrechtzuerhalten. Hinweis: Wir geben gewöhnlich 100 ml frisches supplementiertes IMDM-Medium mit HC, SCF, IL-3 und EPO hinzu, um 245 ml Zellen bei ~0,8x106 Zelle/ml zu erhalten.
      3. Vermehren Sie die MS-5-Zellen (die 60–70 % konfluent sein sollten), indem Sie sie 1:5 in T-175-Flaschen (anstelle von Schalen) mit 0,05 % EDTA enthaltendem Trypsin verdünnen. Die endgültige Zellkonzentration sollte ~0,08x106 Zelle/ml betragen. Hinweis: 61 Flaschen MS-5-Zellen bei ~0,08x106 Zelle/ml sollten vorbereitet werden. Die restlichen MS-5-Zellen sollten eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
    • Tag 8:
      1. Zählen Sie hämatopoetische Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~5 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte sollte ~1x106 Zelle/ml betragen.
      2. Erwärmen Sie 2 L supplementiertes IMDM-Medium, das nur SCF und EPO enthält, vor (Tabelle 2 und 3).
      3. Ernten Sie 200 ml hämatopoetische Kultur (mit ~200x106 Zellen), zentrifugieren Sie bei 200 g für 10 min, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 40 ml supplementiertem IMDM-Medium mit SCF und EPO.
      4. Verteilen Sie die Zellsuspension auf 8 T-175-Flaschen (5 ml pro Flasche) und geben Sie jeweils 245 ml supplementiertes IMDM-Medium mit SCF und EPO hinzu. Hinweis: Wir haben nun 8 Flaschen, von denen jede 250 ml Zellen bei 0,1x106 Zelle/ml enthält.
      5. Die verbleibenden Zellen (~40 ml) am Tag 8 können bei 1–2x106 Zelle/ml in supplementiertem IMDM-Medium mit 10 % DMSO eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
    • Tag 10:
      1. Zählen Sie hämatopoetische Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~5 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte sollte ~1x106 Zelle/ml betragen.
  3. Schritt 2: Tag 11–15
    Etwa die Hälfte der Zellen wird für spätere Verwendung (z. B. Kernextraktion) geerntet. Die verbleibenden erythroiden Zellen werden in supplementiertem IMDM-Medium mit EPO (Tabelle 2 und 3) auf MS-5-Zellen kultiviert. Erythroide Zellen müssen alle 3–4 Tage auf eine neue MS-5-Schicht übertragen werden.
    • Tag 11:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen. Hinweis: Die Zelldichte sollte ~1,5x106 Zelle/ml betragen.
      2. Erwärmen Sie 1 L 1xPBS, 400 ml supplementiertes IMDM-Medium und 5 L supplementiertes IMDM-Medium mit EPO (Tabelle 2 und 3) bei 37 °C vor.
      3. Reservieren Sie ein Kulturvolumen, das 15x108 Zellen entspricht (z. B. ~4 Flaschen mit je 250 ml), und fahren Sie mit Punkt e fort.
      4. Die verbleibenden Zellen (z. B. 15x108) werden in Konischgefäßen gesammelt, bei 450 g 10 min zentrifugiert, in kaltem MS30-Puffer (Tabelle 5) mit 0,1 mM DTT resuspendiert (maximal 108 Zelle/ml) und nach Schnellgefrieren in flüssigem Stickstoff bei -80 °C für spätere Verwendung (z. B. Kernextrakt) gelagert.
      5. Waschen Sie 50 Flaschen konfluenter MS-5-Zellen jeweils mit 20 ml 1xPBS und geben Sie sofort 80 ml frisches supplementiertes IMDM-Medium mit EPO in jede Flasche. Hinweis: Aufgrund der großen Anzahl an Flaschen verarbeiten wir jeweils 4 Flaschen gleichzeitig. Genauer: Wir entnehmen 4 Flaschen konfluenter MS-5-Zellen aus dem Inkubator, waschen sie mit 1xPBS, geben 80 ml Medium hinzu und stellen die Flaschen zurück in den Inkubator. Wenn alle Flaschen vorbereitet und zurückgestellt sind, fahren wir mit Schritt f fort. Da viele Flaschen für ein großskaliges Verfahren verarbeitet werden müssen, ist es vorteilhaft, wenn zwei Personen gleichzeitig arbeiten.
      6. Zentrifugieren Sie das Äquivalent von 15x108 erythroiden Zellen in 4 Konischgefäßen bei 450 g für 10 min und verwerfen Sie den Überstand.
      7. Waschen Sie die 4 Zellpellets jeweils mit 100 ml supplementiertem IMDM-Medium.
      8. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 250 ml supplementiertem IMDM-Medium mit EPO und verteilen Sie jeweils 20 ml dieser Zellsuspension auf die 50 Flaschen mit MS-5-Zellen und 80 ml Medium. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt sollten Sie 50 Flaschen mit konfluenten MS-5-Zellen haben, die jeweils 100 ml erythroider Zellen bei 0,3x106 Zelle/ml enthalten.
      9. Vermehren Sie die verbleibenden 11 Flaschen MS-5-Zellen, indem Sie sie 1:5 in T-175-Flaschen mit 0,05 % EDTA enthaltendem Trypsin verdünnen. Die endgültige Zellkonzentration sollte ~0,08x106 Zelle/ml betragen. Hinweis: 55 Flaschen MS-5-Zellen bei ~0,08x106 Zelle/ml sollten vorbereitet werden.
    • Tag 12:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~4 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte sollte ~0,6x106 Zelle/ml betragen.
    • Tag 14:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~3 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte sollte ~0,9x106 Zelle/ml betragen.
  4. Schritt 3: Tag 15–18
    Einige Zellen werden für spätere Verwendung (z. B. Kernextraktion) geerntet. Die verbleibenden erythroiden Zellen werden auf MS-5-Zellen in supplementiertem IMDM-Medium ohne Zytokine kultiviert.
    • Tag 15:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen. Hinweis: Die Zelldichte sollte ~1x106 Zelle/ml betragen.
      2. Erwärmen Sie 1 L 1xPBS und 5 L supplementiertes IMDM-Medium (Tabelle 2) bei 37 °C vor.
      3. Reservieren Sie ein Kulturvolumen, das 10x108 Zellen entspricht (z. B. ~10 Flaschen mit je 100 ml), und fahren Sie mit Punkt e fort.
      4. Die verbleibenden Zellen (z. B. 40x108) werden geerntet und in kaltem MS30-Puffer (Tabelle 5) mit 0,1 mM DTT resuspendiert, um sie für spätere Verwendung aufzubewahren (siehe Schritt 2: Tag 11, Punkt d).
      5. Waschen Sie 50 Flaschen konfluenter MS-5-Zellen jeweils mit 20 ml 1xPBS und geben Sie sofort 80 ml frisches supplementiertes IMDM-Medium in jede Flasche.
      6. Zentrifugieren Sie das Äquivalent von 10x108 erythroiden Zellen in 4 Konischgefäßen bei 450 g für 10 min und verwerfen Sie den Überstand.
      7. Waschen Sie die 4 Zellpellets jeweils mit 100 ml supplementiertem IMDM-Medium.
      8. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 250 ml supplementiertem IMDM-Medium und verteilen Sie jeweils 20 ml dieser Zellsuspension auf die 50 Flaschen mit MS-5-Zellen und 80 ml Medium. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt sollten Sie 50 Flaschen mit konfluenten MS-5-Zellen haben, die jeweils 100 ml erythroider Zellen bei 0,2x106 Zelle/ml enthalten.
      9. Vermehren Sie die verbleibenden 5 Flaschen MS-5-Zellen, indem Sie sie 1:5 in T-175-Flaschen mit 0,05 % EDTA enthaltendem Trypsin verdünnen. Die endgültige Zellkonzentration sollte ~0,08x106 Zelle/ml betragen. Hinweis: 20 Flaschen MS-5-Zellen bei ~0,08x106 Zelle/ml sollten vorbereitet werden. Die restlichen MS-5-Zellen sollten eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
    • Tag 16:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~4 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte sollte ~0,6x106 Zelle/ml betragen.
  5. Schritt 4: Tag 18–26
    Erythroide Zellen werden 3–4-fach konzentriert, um eine Endkonzentration von 5–7x106 Zelle/ml zu erreichen, und auf der MS-5-Schicht belassen, um die Reifung zu ermöglichen. 10 % FBS werden dem supplementierten IMDM-Medium hinzugefügt, um eine bessere Erhaltung der kultivierten roten Blutkörperchen (cRBCs) zu gewährleisten.
    • Tag 18:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~2 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte sollte ~1,7x106 Zelle/ml betragen.
      2. Erwärmen Sie 300 ml 1xPBS und 1,5 L supplementiertes IMDM-Medium (Tabelle 2) mit 10 % FBS bei 37 °C vor.
      3. Waschen Sie 15 Flaschen konfluenter MS-5-Zellen jeweils mit 20 ml 1xPBS und geben Sie sofort 80 ml frisches supplementiertes IMDM-Medium in jede Flasche.
      4. Zentrifugieren Sie erythroide Zellen (d. h. das Äquivalent von 85x108 Zellen) bei 450 g für 10 min, vereinigen Sie das Pellet und verteilen Sie es auf 4 Konischgefäße.
      5. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 75 ml supplementiertem IMDM-Medium mit 10 % FBS und verteilen Sie jeweils 20 ml dieser Zellsuspension auf die 15 Flaschen mit MS-5-Zellen und 80 ml Medium. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt sollten Sie 15 Flaschen mit konfluenten MS-5-Zellen haben, die jeweils 100 ml erythroider Zellen bei 6x106 Zelle/ml enthalten.
      6. Vermehren Sie die verbleibenden 5 Flaschen MS-5-Zellen, indem Sie sie 1:5 in T-175-Flaschen mit 0,05 % EDTA enthaltendem Trypsin verdünnen. Die endgültige Zellkonzentration sollte ~0,08x106 Zelle/ml betragen. Hinweis: 20 Flaschen MS-5-Zellen bei ~0,08x106 Zelle/ml sollten vorbereitet werden. Die restlichen MS-5-Zellen sollten eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
    • Tag 20:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~1,5 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte wird bei ~1,5x106 Zelle/ml gehalten.
    • Tag 22:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~1,5 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte wird bei ~1,5x106 Zelle/ml gehalten.
      2. Wechseln Sie das Medium und übertragen Sie die erythroiden Zellen auf neue MS-5-Schichten, wie am Tag 18 beschrieben.
    • Tag 24:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~1,5 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte wird bei ~1,5x106 Zelle/ml gehalten.
    • Tag 26:
      1. Zählen Sie erythroide Zellen mit Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen, und ernten Sie die erforderliche Anzahl Zellen (d. h. ~1,5 ml Kultur) für Tests (siehe Absatz 6). Hinweis: Die Zelldichte wird bei ~1,5x106 Zelle/ml gehalten.
      2. Ernten Sie die nicht-adhärenten, entkernten und vollständig hämoglobinisierten cRBCs. Hinweis: Reife cRBCs können bis zu einem Monat in SAGM-Medium (MacoPharma) bei 4 °C aufbewahrt werden.
  6. Tests und repräsentative Ergebnisse
    Die folgenden Tests werden an den angegebenen Tagen durchgeführt, um eine korrekte Zellproliferation und erythroide Differenzierung zu überprüfen. Die in den Abbildungen dargestellten repräsentativen Ergebnisse wurden mit aus Leukozytapherese isolierten CD34+-Zellen erzielt.
    1. Die Zellen werden alle zwei Tage gezählt. Siehe repräsentatives Ergebnis der Zellproliferation in Abbildung 2.
    2. Die May-Grünwald-Giemsa-Färbung zur Morphologieanalyse wird alle zwei Tage durchgeführt, wobei 0,05 x106 Zellen für die Tage 0 bis 8 und 0,2x106 Zellen für die folgenden Tage verwendet werden, gemäß den Anweisungen des Herstellers der Giemsa-Färbung (Tabelle 1). Siehe repräsentative Ergebnisse in Abbildung 3.
    3. Semifeste Assays werden dupliziert durchgeführt, um hämatopoetische Vorläuferzellen alle zwei Tage von Tag 0 bis Tag 12 mit jeweils 0,01x106 Zellen pro Assay zu messen, gemäß den Anweisungen des Herstellers des Methocult-Halbfestmediums (Tabelle 1). Siehe repräsentative Ergebnisse in Abbildung 4.
    4. Die Analyse der folgenden Zellmarker erfolgt alle zwei Tage mittels FACS: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS, jeweils mit 0,2 x106 Zellen pro Assay. Siehe repräsentative Ergebnisse in Abbildung 5.
    5. Der Hämoglobingehalt wird alle zwei Tage mittels Benzidinfärbung gemessen. Siehe repräsentative Ergebnisse in Abbildung 5.
    6. Die Genexpression wird mittels RT-qPCR oder Microarray nach RNA-Extraktion aus 1x106 Zellen untersucht. Siehe repräsentative Ergebnisse in Abbildung 6B.

Kommentare zu den Ergebnissen:

Abbildung 1 zeigt das Protokoll zur ex vivo-Differenzierung menschlicher CD34+-Zellen zu reifen, hämoglobinhaltigen roten Blutkörperchen. Während der erythroiden Differenzierung sind die Zellen stark proliferativ, wie die etwa 8.000-fache Amplifikation in Abbildung 2 veranschaulicht, die mit aus Leukapherese isolierten CD34+-Zellen erzielt wurde. Aus Knochenmark isolierte CD34+-Zellen weisen eine leicht geringere Proliferationsrate mit einer etwa 6.000-fachen Amplifikation auf, während aus Nabelschnurblut isolierte CD34+-Zellen eine 50.000-fache Amplifikation erreichen können. Zellen in bestimmten Differenzierungsstadien zeigen charakteristische Größen und Morphologien, die in Abbildung 3 dargestellt sind. Beachten Sie den Enukleierungsprozess, der am Ende der Differenzierung ab Tag 20 einsetzt. Bis Tag 26 haben alle Zellen ihre Kerne verloren (Abbildung 3).

Die in Abbildung 4 gezeigten Koloniebildungsassays dienen zum Nachweis früher und später hämatopoetischer Vorläuferzellen während der ersten Tage der Differenzierung (Tag 0 bis Tag 8). Neben erythroiden Vorläuferzellen (CFU-E und BFU-E) stellen wir fest, dass auch granulozytär-makrophage Vorläuferzellen (CFU-GM) innerhalb der frühen CD34+-Zellen am Tag 0 deutlich vertreten sind. Im Verlauf der Differenzierung nehmen die CFU-GM signifikant ab und sind am Tag 6 vollständig durch erythroide Vorläuferzellen BFU-E und CFU-E ersetzt. Ebenso wichtig ist die Beobachtung, dass von Tag 4 bis Tag 6 die frühen erythroiden Vorläuferzellen BFU-E schrittweise durch ihre differenzierteren Gegenstücke CFU-E ersetzt werden. Bis zum Tag 10 haben erythroide Zellen im Wesentlichen ihre koloniebildende Kapazität verloren.

Abschließend wird die Erythropoese durch die Expression von Oberflächenmarkern der Zelle überwacht, wie in Abbildung 5 dargestellt. Hinweis: 1) der fortschreitende Verlust des hämatopoetischen Stamm-/Vorläufer-Markers CD34; 2) der fortschreitende Erwerb und Verlust des Vorläufer-Markers CD36; 3) der fortschreitende Erwerb und Verlust des erythroiden Vorläufer- und Retikulozyten-Markers CD71; und 4) die Zunahme des Markers GPA für erythroide Vorläuferzellen und Erythrozyten. Weitere Marker der erythroiden Differenzierung umfassen die Hämoglobinsynthese, die ab Tag 8 einsetzt (gemessen mittels Benzidinfärbung – Abbildung 5), sowie die Enukleation der Zellen, die ab Tag 20 beginnt und durch den Verlust der DNA-Färbung mit LDS gemessen wird (Abbildung 5). Schließlich kann die erythroide Differenzierung auch mittels RT-qPCR von molekularen Markern wie dem Transkriptionsfaktor TAL1 (Abbildung 6B) oder den β-Globin-Genen (Daten nicht gezeigt) quantifiziert werden.

Typischerweise liefert 1 ml Nabelschnurblut / Leukozytenapherese / Knochenmark 0,35×105 / 0,5×105 / 1,1×105 CD34+-Zellen, die theoretisch 1,7×109 / 0,4×109 / 0,7×109 rote Blutkörperchen mit entsprechenden Proliferationsraten von 50.000 / 8.000 / 6.000 erzeugen können. Um am Ende des Differenzierungsverfahrens 50×106 rote Blutkörperchen zu erhalten, benötigen Sie etwa 50 ml Kulturmedium.

Teil II. Lentivirale vermittelte Herunterregulation während der ex vivo Erythroiddifferenzierung

Lentiviren sind ein bevorzugtes Werkzeug für den Gentransfer in humane primäre Zellen (siehe beispielsweise Amsellem et al. 9). Lentiviren werden häufig verwendet, um Gene gezielt in primären Zellen mittels gezielter shRNA-Übertragung herunterzuregulieren (siehe beispielsweise Laurenti et al. 10). In diesem Protokoll richten wir uns gegen den Transkriptionsfaktor TAL1 in primären humanen erythroiden Zellen. Als negativen Kontrollansatz dient eine shRNA mit einer zufällig zusammengestellten Sequenz, die keiner bekannten Gensequenz entspricht. Die Expression von GFP wird zur Beurteilung der Transduktionseffizienz herangezogen.

1. Herstellung von lentiviralen Vektorpartikeln

Um lentivirale Partikel zu erhalten, werden humane embryonale Nierenzellen 293T mit drei Plasmiden kotransfiziert: einem Plasmid, das ein Viruspakksystem der zweiten Generation enthält und für HIV-1-Gene kodiert, mit Ausnahme von env, vpr, vif, vpu und nef (d. h. psPAX2); einem, das für die Hülle des vesikulären Stomatitis-Virus mit G-Pseudotypisierung kodiert (d. h. pMD2G); und einem lentiviralen Vektor, der für das Gen von Interesse kodiert (d. h. pBLOCK-it6-DEST(shTal1), das für TAL1-shRNA kodiert, pBLOCK-it6-DEST(shScr), das für eine scrambelte shRNA kodiert, oder pWPIP, das für GFP kodiert) (Tabelle 4). Lentivirale Partikel werden aus dem Kulturüberstand der transfizierten 293T-Zellen gewonnen.

Um eine unerwünschte Infektion von Zellen zu vermeiden, führen wir alle Lentivirus-Experimente (Viruspräparation und Infektion) unter einem separaten Sicherheitswerkbank durch, die von anderen Zellkulturen getrennt ist. Außerdem wird Lentivirus-bedingter Abfall gesondert entsorgt. Die in diesem Protokoll beschriebenen Lentiviren der zweiten Generation sind replikationsinkompetent und sollten als Organismen der Sicherheitsstufe 2 eingestuft werden. Einige Institutionen verfügen möglicherweise über spezifische Sicherheitsvorschriften für Lentiviren, und wir empfehlen, die geltenden institutionellen Richtlinien zu befolgen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das ausreichend lentivirale Partikel liefert, um 1 bis 2 Millionen primäre erythroide Zellen in einem beliebigen Differenzierungsstadium zu infizieren. Die Volumina sollten entsprechend angepasst werden, wenn die Ansätze vergrößert oder verkleinert werden. Siehe Tabellen 4 und 5 für Reagenzien.

  1. Transfektion von 293T-Zellen mit Calciumphosphat.
    1. Ein Tag vor der Transfektion 13,2 × 106 293T-Zellen in 20 ml DMEM/Hochglukose-Medium mit 10 % FBS und Pen/Strep in einer 15-cm-Zellkulturschale aussäen. ANMERKUNG: Dadurch sollten die Zellen am Tag der Transfektion eine Konfluenz von 70 % erreichen. Die besten Ergebnisse werden mit Zellen niedriger Passage (<20) erzielt.
      Optional: Schalen können mit Typ-I-Kollagen oder Poly-L-Lysin beschichtet werden, um die Adhärenz der 293T-Zellen zu verbessern.
    2. Zwei Stunden vor der Transfektion das Medium der 293T-Zellen absaugen und vorsichtig 20 ml frisches, auf 37 °C vorgewärmtes Medium hinzufügen. ANMERKUNG: Wir beginnen die Transfektion gewöhnlich am Ende des Tages.
    3. Mischen Sie die folgenden Reagenzien in einem 5-ml-Röhrchen:
      • 44,8 μg Expressionsvektor für das Gen Ihrer Wahl (z. B. shRNA oder GFP – siehe Tabelle 4)
      • 13,35 μg pMD2.G Hüllvektor
      • 33,48 μg psPAX2 Verpackungsvektor
      • Steriles H2O hinzufügen, um das Volumen auf 1,116 ml aufzufüllen.
    4. Steriles H2O hinzufügen, um das Volumen auf 1,116 ml aufzufüllen.
    5. 109,8 μl CaCl2 2,5 M hinzufügen und vortexen, um zu mischen.
    6. In ein 50-ml-Konischglas 1,116 ml 2xHBS-Puffer (Tabelle 5) geben.
    7. Unter ständigem Vortexen die DNA-Mischung tropfenweise in den 2xHBS-Puffer geben.
    8. Den Niederschlag 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) entstehen lassen (nicht länger als 30 Minuten).
    9. Die 2,3-ml-Lösung tropfenweise der Schale mit den 293T-Zellen hinzufügen, vorsichtig schwenken und die Zellen für 12–14 Stunden in einen 37 °C warmen Inkubator stellen.
    10. Am nächsten Morgen früh das Medium absaugen und durch 20 ml frisches, auf 37 °C vorgewärmtes Medium ersetzen.
  2. Sammlung und Konzentrierung von Lentivirus
    1. 48 Stunden nach der Transfektion 20 ml Medium, das das Lentivirus enthält, sammeln und in ein 50-ml-Konischglas überführen.
    2. 20 ml auf 37 °C vorgewärmtes Medium zu den 293T-Zellen hinzufügen und diese zurück in den Inkubator stellen.
    3. Das virale Überstandmedium 10 Minuten bei 450 g zentrifugieren, um Zelltrümmer zu entfernen, und in ein neues 50-ml-Röhrchen überführen. Alternativ kann der Überstand durch einen 0,45-μm-Filter filtriert werden. Den geklärten Überstand bei 4 °C lagern.
    4. Ein Tag später die verbleibenden 20 ml Medium sammeln. ANMERKUNG: Wir stellen fest, dass die Virustiter in beiden Sammlungen etwa gleich sind, d. h. 1 × 106 TU/ml.
    5. Zur Konzentrierung der Viren werden die viralen Überstände in Beckman-OptiSeal-Röhrchen verteilt (32,4 ml Überstand pro Röhrchen) und bei 4 °C für 1,5 h mit 100.000 g unter Verwendung eines Schwenkrotors zentrifugiert. ANMERKUNG: Alternative Methoden zur Konzentrierung des Virusüberstandes umfassen die Zentrifugation bei 47.000 g für 2 h oder bei 3.000 g für 8 h. Das Virus vor der Konzentrierung nicht einfrieren. Durch Einfrieren fallen Proteine aus, was das Wiederaufnehmen des Virus erschwert.
    6. Unmittelbar nach der Ultrazentrifugation das Überstandmedium langsam mit einer 10-ml-Kunststoffpipette absaugen und verwerfen. ANMERKUNG: Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, da es leicht von der Röhrchenwand abgelöst werden kann. Nach dem Absaugen der ersten 5 ml Überstand schneiden wir gewöhnlich die Oberseite des Ultrazentrifugenröhrchens ab, um so viel Überstand wie möglich zu entfernen, d. h. etwa 100–200 μl Medium am Röhrchenboden verbleiben lassen.
    7. 100 μl 1xPBS hinzufügen, das Pellet 30 Minuten bei Raumtemperatur auflösen lassen und durch 15–20-maliges Auf- und Abpipettieren resuspendieren. ANMERKUNG: Typischerweise erhalten wir etwa 200–300 μl konzentriertes Virus.
    8. Die konzentrierte Lentivirus-Präparation wird anhand eines Protokolls von Invitrogen (Block-it Lentiviral RNAi Expression System) an NIH3T3-Zellen titriert. ANMERKUNG: Wir erhalten typischerweise Virustiter von 2 bis 10 × 108 transduzierenden Einheiten (TU)/ml.
    9. Das Virus kann nun zur Infektion verwendet (siehe Abschnitt 2), portioniert und bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden. ANMERKUNG: Viruspräparationen nicht mehr als einem Gefrier-Tau-Zyklus aussetzen. Viren sind 4–5 Stunden bei 37 °C, 2–3 Tage bei Raumtemperatur oder eine Woche bei 4 °C stabil.

2. Lentivirale Infektion primärer erythroider Zellen zur Genübertragung

  1. Infektion
    Nukleäre erythroide Zellen können in jedem Differenzierungsstadium effizient infiziert werden, solange ein hohes MOI (Multiplizität der Infektion) von 50–100 verwendet wird. Hier beschreiben wir ein typisches Experiment, bei dem Lentiviren, die einen TAL1- oder einen kontrollierten (scramble) shRNA-Ausdruck vermitteln, verwendet werden, um erythroide Zellen am Tag 8 und 9 der Differenzierung mit einem MOI von 50 TU/Zelle zu infizieren. RNA wird alle 24 Stunden extrahiert, um den Grad der TAL1-Genunterdrückung (KD) mittels RT-qPCR zu überprüfen. Die GFP-Expression wird parallel mittels FACS zur Beurteilung der Infektionseffizienz gemessen (siehe repräsentative Ergebnisse in Abbildung 6).
    • Tag 0:
      1. Bereiten Sie drei kegelförmige 15-ml-Röhrchen vor, die jeweils 1×106 erythroide Zellen enthalten (d. h. ein Röhrchen für die TAL1-Genunterdrückung, ein Röhrchen für die scrambeld negative Kontrolle, ein Röhrchen für die GFP-Expressionskontrolle).
      2. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml IMDM-Medium mit Zusätzen, das SCF und EPO enthält (siehe Teil I), zentrifugieren Sie bei 200 g für 5 min und entfernen Sie so viel Überstand wie möglich.
      3. Geben Sie Polybrene (Tabelle 4) in die konzentrierte Viruslösung, um eine Endkonzentration von 40 μg/ml zu erreichen.
      4. Geben Sie 100 μl konzentriertes Virus (d. h. 5×107 TU) mit Polybrene zu jedem Röhrchen mit erythroiden Zellen hinzu.
      5. Inkubieren Sie 1 h im Brutschrank bei 37 °C und mischen Sie alle 10 min durch leichtes Antippen mit dem Finger. Anmerkung: Die Infektion sollte in einem minimalen Mediumvolumen durchgeführt werden, um eine maximale Adsorption des Lentivirus an die Zellen zu ermöglichen. Zudem sorgt das Mischen alle 10 min für eine gleichmäßige Verteilung des Virus auf die Zellen.
      6. Geben Sie 900 μl IMDM-Medium mit Zusätzen, das SCF und EPO enthält (Tabellen 2 und 3), in jedes Röhrchen hinzu.
      7. Überführen Sie jede Probe in eine Vertiefung einer 6-Loch-Platte und stellen Sie sie für 24 h in den Brutschrank bei 37 °C.
    • Tag 1: Sammeln Sie die Zellen in separaten 15-ml-Röhrchen, zentrifugieren Sie bei 200 g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Infektion (Schritte b bis g oben).
    • Tag 2: Waschen Sie die Zellen, resuspendieren Sie sie bei 0,2×106 Zellen/ml in IMDM-Medium mit Zusätzen, das SCF und EPO enthält, und fahren Sie wie in Teil I fort.
  2. Repräsentative Ergebnisse
    Abbildung 6A veranschaulicht das Protokoll zur Lentivirus-Infektion primärer erythroider Zellen, gefolgt von der RNA-Extraktion. In einem Experiment infizierten wir erythroide Zellen mit Lentiviren, die einen shRNA-Ausdruck gegen den Transkriptionsfaktor TAL1 oder eine scrambeld Kontrolle erzeugten11. Abbildung 6B zeigt, dass wir erfolgreich 75 % der TAL1-Transkripte in primären erythroiden Zellen herunterregulieren konnten. Beachten Sie auch die Zunahme des TAL1-Transkriptspiegels vom Tag 9 bis Tag 12 in der scrambeld Kontrolle, was die Bedeutung dieses Transkriptionsfaktors während der erythroiden Differenzierung unterstreicht. In einem weiteren Experiment infizierten wir erythroide Zellen mit Lentiviren, die das GFP-Protein exprimieren. Abbildung 6C zeigt, dass drei Tage nach der Infektion die meisten erythroiden Zellen (87 %) GFP exprimieren, gemessen mittels Fluoreszenz unter dem Mikroskop und mittels FACS. Dies deutet auf eine hohe Infektionseffizienz in primären erythroiden Zellen hin. Zuvor hatten wir CD34+-Zellen am Tag 0 mit ähnlicher Effizienz infiziert (Daten nicht gezeigt). Der wichtigste Parameter für eine effiziente Transduktion primärer Zellen ist die Verwendung eines hohen MOI (d. h. konzentrierte Lentiviren). Bei Verwendung eines niedrigen MOI (d. h. nicht konzentriertes Virus) nimmt die Transduktionseffizienz ab.

3. Repräsentative Ergebnisse

Diagram zur positiven Isolierung von CD34+ HSCs; immunmagnetische Trennung, serumfreie erythroide Differenzierung.
Abbildung 1. Übersicht des Protokolls zur Isolierung und ex vivo erythroiden Differenzierung menschlicher primärer hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen. (Schritt 1) CD34+-Zellen (Reinheit von 95 ± 3 %) werden aus Nabelschnurblut, Knochenmark oder humanem peripherem Blut, das mit G-CSF mobilisiert wurde (Leukapherese), mittels positiver immunmagnetischer Selektion isoliert. (Schritt 2) Die CD34+-Zellen werden in Flüssigkultur gemäß dem angegebenen Vier-Schritte-Protokoll kultiviert.

Zellvermehrungsdiagramm; logarithmische Skala; Kulturtage im Vergleich zur Trendanalyse des Zellwachstums.
Abbildung 2. Zellvermehrung während des ex vivo Erythroiddifferenzierungsprotokolls. Die Ergebnisse sind in logarithmischer Skala dargestellt. Stellvertretende Ergebnisse, erzielt mit CD34+-Zellen, isoliert aus Leukozytenapherese.

Schema der Erythropoese-Stadien, mikroskopische Bilder zur Verfolgung der roten Blutkörperchen-Entwicklung über 26 Tage.
Abbildung 3. Morphologische Zellanalyse während der ex vivo Erythroiddifferenzierung. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten während der Differenzierung mit May-Grünwald-Giemsa-Anfärbung gefärbt (Vergrößerung × 40). HSC: hämatopoetische Stamm- bzw. Vorläuferzellen; BFU-E: burstbildende Einheiten – erythroid; CFU-E: koloniebildende Einheiten – erythroid; Pro EB: Pro-Erythroblasten; Baso EB: basophile Erythroblasten; Poly EB: polychromatophile Erythroblasten; Ortho EB: orthochromatische Erythroblasten; RET: Retikulozyten; RBC: rote Blutkörperchen.

Diagramm des halbfesten Assays; Wachstum von Vorläuferzellen CFU-GM, BFU-E, CFU-E; Kultivierungstage; Bildvergleich.
Abbildung 4. Koloniebildende-Zelle-(CFC)-Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung hämatopoetischer Vorläuferzellen. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden 104 Zellen in einem halbfesten Methylzellulose-Medium unter Zugabe rekombinanter humaner Zytokine kultiviert: rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO, um das optimale Wachstum erythroider Vorläuferzellen (BFU-E und CFU-E) sowie granulozytär-makrophager Vorläuferzellen (CFU-GM) zu unterstützen. BFU: Burst-bildende Einheiten; CFU: Kolonie-bildende Einheiten. Typische Abbildungen von BFU-E und CFU-E sind ebenfalls dargestellt. Beachten Sie die rotbraune Färbung infolge der Hämoglobinbildung in BFU-E und CFU-E.

Diagramme der hämatopoetischen Differenzierung mit Zellmarkern CD34, CD36, CD71, GPA, Benzidin, LDS über die Zeit
Abbildung 5. Kinetik hämatopoetischer/erythroider Marker während der ex vivo-Erythroiddifferenzierung. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden 2×105 Zellen gewonnen und mittels FACS (CD34, CD36, CD71, GPA und LDS) oder Mikroskopie (Benzidin) auf die Expression der angegebenen Marker analysiert. Die Balken zeigen die Prozentsätze positiver Zellen an. CD34: transmembranäres Glykoprotein, vorhanden auf humanen hämatopoetischen Stamm- bzw. Vorläuferzellen; CD36: Thrombospondinrezeptor, vorhanden auf Vorläuferzellen; CD71: Transferrinrezeptor, vorhanden auf erythroiden Vorläuferzellen und Retikulozyten; GPA: Glykophorin A, vorhanden auf erythroiden Vorläuferzellen und Erythrozyten; Benzidin: Hämoglobin-Färbemittel; LDS: Laserfarbstoff Styryl, DNA-Färbemittel.

Zeitplan der Lentivirus-shRNA-Infektion, Balkendiagramm der TAL1-mRNA-Expression, GFP-Mikroskopie, Durchflusszytometrie.
Abbildung 6. Lentiviral vermittelte Genübertragung in primären humanen Proerythroblasten. (A) Zeitplan zur Induktion der TAL1-Genstilllegung (KD) in primären Proerythroblasten unter Verwendung des lentiviralen Gentransfersystems. (B) Die TAL1-Genstilllegung wurde durch lentiviral übermittelte anti-Tal1-shRNA (TAL1 KD) oder eine kontrollierte, zufällig sortierte shRNA (Scr) vermittelt. Die Kinetik des TAL1-mRNA-Spiegels wurde mittels RT-qPCR gemessen. Der TAL1-Transkriptspiegel wird relativ zu 18S-RNA angegeben. (C) Die durch Lentivirus übertragene GFP-Expression wurde mittels Mikroskopie (linkes Panel) oder FACS (rechtes Panel) überprüft. 87 % der Zellen waren GFP-positiv.

4. Materialien

ReagenzQuelleKatalognummer
RPMI 1640 SigmaR8758
Collagenase BRoche Applied Science11088807001
DNase ISigmaD5025-15KU
Präseparationsfilter (30μm Nylonmasche)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x Puffer zur Lyse roter BlutkörperchenStemCell Technologies20120
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec Inc130-046-703
LS Mini-Macs-SäulenMiltenyi Biotec Inc130-042-401
autoMACS Laufpuffer – MACS-AufreinigungspufferMiltenyi Biotec Inc130-091-221
MiniMACS SeparatorsystemMiltenyi Biotec Inc130-042-102
Maus-Knochenmark-stromale Zellen MS-5 (regelmäßig auf Mykoplasmenkontamination getestet)DSMZACC 441
Trypanblaulösung (0,4 %)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Trypsin 0,05 %/EDTAThermoScientific J101521
May-Grünwald-GiemsaBiostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Methocult Kolonie-bildende Zell-(CFC-)Assays für humane Zellen StemCell Technologies 04044

Tabelle 1.

KomponenteStammlösungVolumen 600 ml
IMDMSigma I3390443,4 ml
Pen/Strept 1 % (vol/vol)Gibco 103786 ml
L-Glutamin 4x10-3M200 mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40 μg/ml4 mg/ml (Sigma I5125)
Zubereitung: 28 mg Pulver in 7 ml IMDM lösen und filtrieren; steril, haltbar 1 Woche bei 4 °C.		6 ml
Folsäure 10 μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
Zubereitung: 7 mg Pulver in 7 ml vorgewärmtem IMDM lösen und filtrieren; steril, haltbar 1 Woche bei 4 °C. Vor Gebrauch vorgewärmt.		6 ml
Monothioglycerol 1,6x10-4M0,16 M (Sigma M6145)
Zubereitung: 10 μl der 11,56 M Stammlösung in 712 μl IMDM lösen und filtrieren; steril, haltbar 1 Woche bei 4 °C.		0,6 ml
Eisennitrat 90 ng/ml18 μg/ml (Sigma 8508)
Zubereitung: 1,8 mg in 1 ml destilliertem Wasser lösen. 0,1 ml entnehmen, mit 9,9 ml IMDM auffüllen und filtrieren; steril, haltbar 1 Woche bei 4 °C.		3 ml
Eisensulfat 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
Zubereitung: 18 mg in 1 ml destilliertem Wasser lösen. 0,1 ml entnehmen, mit 9,9 ml IMDM auffüllen und filtrieren; steril, haltbar 1 Woche bei 4 °C.		3 ml
Rinderserumalbumin-Insulin-Transferrin (BIT)
20 % (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

Tabelle 2.

KomponenteStammlösungVolumen, das 100 ml ergänztem IMDM hinzugefügt wird (Tabelle 2)
Hydrocortison (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
Zubereitung: 5 mg Pulver in 1,03 ml IMDM lösen. 0,1 ml entnehmen, mit 9,9 ml IMDM auffüllen und filtrieren, um steril zu machen. Haltbar 1 Woche bei 4 °C.		1 ml
Stammzellfaktor (SCF) 100 ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
Zubereitung: 50 μg Pulver in 500 μl PBS + 0,1 % BSA lösen und filtrieren, um steril zu machen. Aliquots à 100 μl herstellen und bei -20 °C lagern.		100 μl
Erythropoietin (EPO) 3 IU/ml100 μg/ml entsprechend 12.000 IU/ml (Feldan FB03-10-290)
Zubereitung: 50 μg Pulver in 500 ml PBS + 0,1 % BSA lösen und filtrieren, um steril zu machen. Aliquots à 25 ml herstellen und bei -20 °C lagern.		25 μl
Interleukin 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
Zubereitung: 10 μg Pulver in 100 μl PBS + 0,1 % BSA lösen und filtrieren, um steril zu machen. Aliquots à 5 ml herstellen und bei -20 °C lagern.		5 μl

Tabelle 3.

ReagenzQuelleReferenz
293T-Zellen
(regelmäßig auf Mykoplasmenkontamination testen)		ATCCCRL-11268
DMEM/HochglukoseThermoScientificSH30243.01
Hexadimethrinbromid (Polybrene)SigmaH9268-5G
OptiSeal-UltrazentrifrohreBeckman Coulter361625
psPAX2-PlasmidAddgene (Labor D. Trono)12260
pMD2.G-PlasmidAddgene (Labor D. Trono)12259
pBLOCK-it6-DEST (shTal1)-PlasmidTal1-shRNA-Sequenz, kloniert in das pBLOCK-it6-DEST-Plasmid von InvitrogenPalii et al. EMBO J.
pBLOCK-it6-DEST (shScr)-PlasmidVerwürfelte shRNA-Sequenz, kloniert in das pBLOCK-it6-DEST-Plasmid von InvitrogenPalii et al. EMBO J.
pWPI-PlasmidAddgene (Labor D. Trono)12254

Tabelle 4.

PufferZubereitungEndkonzentration
2xHBS
  • 1,6 g NaCl
  • 1,3 g HEPES
  • 0,04 g Na2HPO4(7H2O)
  • Milli-Q-Wasser hinzufügen.
  • Den pH-Wert durch Zugabe von NaOH-Lösung exakt auf 7,11–7,13 einstellen und Milli-Q-Wasser bis auf 100 ml auffüllen.
  • Den pH-Wert feinjustieren auf 7,11–7,13.
  • Steril filtrieren, 10-ml-Aliquote herstellen und bei -200 °C lagern.
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1,5 mM
CaCl2
  • 2,77 g wasserfreies CaCl2
  • In 10 ml Milli-Q-Wasser lösen.
  • Steril filtrieren, 1-ml-Aliquote herstellen und bei -20 °C lagern.
  • 2,5 M
MS30
  • 25 ml [2 M] Tris, pH 8,0
  • 5 ml [0,5 M] EDTA
  • 300 ml Glycerin
  • 50 mM
  • 2,5 mM
  • 30 % (V/V)

Tabelle 5.

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Diskussion

Eine Reihe von Methoden wurden bereits zu erythroiden Zellen in Kultur zu differenzieren mit variabler Grad von Erfolg eingesetzt. Zum Beispiel können einige Protokolle ohne Co-Kultur auf MS-5 Ausbau der erythroiden Zellen sind aber nicht in der Herstellung von voll ausgereiften entkernte rote Blutkörperchen 12-17 effizient. Während bei anderen Methoden effizienter Enukleation ermöglichen, ist es auf Kosten der Verbreitung 18,19. Die Methode, die wir hier verwendet haben, zunächst von der Douay Lab...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Wir danken L. Douay und MC Giarratana (Université Paris VI, Frankreich) für Beratung bei der ex vivo erythroiden Differenzierung, D. Allan und H. Atkins (Ohří, Kanada) für die Bereitstellung von Blutproben (erhalten unter der Ottawa Hospital Research Ethics Board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) für die Bereitstellung der lentiviralen Vektoren und FJ Dilworth (Ohří, Kanada) für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Dieses Projekt wurde von einem CIHR gewähren (MOP-82813), um MBCGP finanziert ist ein Empfänger einer Ontario Research Fund Computational Regulomics Ausbildung Postdoktoranden-Stipendium. MB hält den Canada Research Chair in der Regulation der Genexpression.

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Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen
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