Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety

Zusammenfassung

Lentiviren sind eine wertvolle Recherche-Tool für die Erkundung der Genfunktion, aber Forscher möge Produktion von pantropic Lentivirus Kodierung bekannten oder vermuteten Onkogene zu vermeiden. Als Alternative stellen wir ein sicheres Protokoll für die Verwendung von ecotropen Lentivirus auf menschliche Zellen geändert, um die ecotropen Rezeptor mSlc7a1 auszudrücken.

Zusammenfassung

Stamm-und Tumor-Zellbiologie Studien erfordern häufig virale Transduktion humaner Zellen mit bekannter oder vermuteter Onkogene, Erhöhung wichtigen Fragen der Sicherheit für das Laborpersonal. Pantropic Lentiviren, wie die häufig verwendeten VSV-G Pseudotyp, sind ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion, weil sie vielen Zelltypen, einschließlich nicht-teilenden Zellen transduzieren. Allerdings können Forscher wollen Produktions-und Zentrifugation pantropic Viren kodieren Onkogene durch höhere Sicherheitsstufe Umgang mit Anforderungen und Fragen der Sicherheit zu vermeiden. Mehrere starke Onkogene, einschließlich c-Myc und SV40 large T-Antigen, sind bekannt, die Produktion von induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSC) zu verbessern. Alle anderen bekannten iPSC-induzierenden genetischen Veränderungen (Oct4, Sox2, Klf4, NANOG, LIN28 und p53 Verlust der Funktion) auch Links zu Krebs, so dass sie relativ hoher Sicherheit betreffen, sowie.

Während diese im Zusammenhang mit Krebs Viren nützlich beim Studium der Reprogrammierung und Pluripotenz sind, müssen sie sicher verwendet werden. Um diese Fragen der biologischen Sicherheit, zeigen wir eine Methode zur Transduktion humaner Zellen mit ecotropen Lentivirus, mit zusätzlichem Schwerpunkt auf reduzierte Kosten und eine bequeme Handhabung. Wir haben ecotropen Lentivirus mit einer ausreichend hohen Titer produziert, um mehr als 90% der transduzieren-Rezeptor-exprimierenden menschlichen Zellen mit dem Virus, der Validierung der Wirksamkeit dieses Ansatzes.

Lentivirus ist oft durch Ultrazentrifugation konzentriert, allerdings dauert dieser Vorgang mehrere Stunden und kann Aerosole Infektionskrankheiten des Menschen biomedizinische Forscher produzieren. Als Alternative, virale Partikel können mehr sicher auf Zellen werden durch Komplexierung mit Chondroitinsulfat und Polybren (CS / PB) sedimentiert. Diese Technik erhöht die funktionelle virale Titer von bis zu 3-fach in den Zellen stabil exprimieren Mäuse-Retrovirus-Rezeptor, mit vernachlässigbaren zusätzlichen Zeit-und Kosten. Transduktion von humanen dermalen Fibroblasten (HDF) ist maximal erweitert mit CS / PB-Konzentrationen etwa 4-fach niedriger als der optimale Wert zuvor für Krebszelllinien gemeldet, was darauf hindeutet, dass Polymer-Konzentration für die Zielzelle Art der Verzinsung sollte titriert werden. Deshalb beschreiben die Verwendung von methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid (MTT) zum Testen auf Polymer-Toxizität in einem neuen Zelltyp. Wir beobachten, entspricht Lebensfähigkeit der HDF nach einer viralen Transduktion entweder mit Polymer-Komplexierung oder der Standard-Dosierung von Polybren (PB, 6 pg / ml), was darauf hinweist minimal akute Toxizität.

In diesem Protokoll, beschreiben wir die Verwendung von ecotropen Lentivirus für die Überexpression von Onkogenen in menschlichen Zellen, wodurch die biologische Sicherheit Risiken und die Erhöhung der Transduktion Rate. Wir zeigen auch die Verwendung von Polymer-Komplexierung Transduktion zu verbessern und gleichzeitig die Vermeidung aerosolbildende Zentrifugation von Viruspartikeln.

Protokoll

1. Produktion, Gewinnung und Einfrieren von Lentivirus

1. Konsultieren Sie vor Beginn dieses Protokolls Ihren institutionellen Sicherheitsbeauftragten und befolgen Sie die empfohlenen Sicherheitsrichtlinien.
2. Tag 1. Beginnen Sie mit gesunden, schnell wachsenden 293T-Zellen zur Virusproduktion. Säen Sie die Zellen mit 5 x 10⁶ Zellen pro 10 cm-Platte aus. Verwenden Sie antibiotikafreies 293T-Medium (DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % FBS und 4 mM L-Glutamin) für die Virusproduktion.
3. Tag 2. Transfizieren Sie am späten Nachmittag die 293T-Zellen wie folgt (Angaben beziehen sich auf eine 10 cm-Platte). Lassen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmen. Pipettieren Sie 375 μl OptiMEM in ein Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie dann 25 μl Fugene HD hinzu. Vermeiden Sie, dass unverdünntes Fugene mit der Innenwand des Röhrchens in Kontakt kommt.
4. Mischen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen:
   • 5 μg Transferplasmid (Slc7a1, Zielvektor oder fluoreszierender Kontrollvektor)
   • 3,75 μg Packungsplasmid (pCMV-dR8.91 oder psPax2)
   • 1,25 μg Hüllplasmid (pMD2.G für pantropisch, pHCMV-EcoEnv für ekotropisch)
   • serumfreies OptiMEM auf ein Gesamtvolumen von 100 μl
5. Vereinigen Sie die Inhalte beider Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung 20–30 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Ersetzen Sie das Medium der 293T-Zellen durch 10 ml frisches, antibiotikafreies 293T-Medium. Geben Sie die Fugene/Plasmid-Mischung tropfenweise auf die Zellen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂.
7. Tag 3. Ersetzen Sie das Medium der 293T-Zellen durch 10 ml frisches, antibiotikafreies 293T-Medium. Arbeiten Sie vorsichtig, da die 293T-Zellen nur locker haften und durch zu starkes Aufpipettieren des Mediums von der Zellschicht abgelöst werden können. Inkubieren Sie zwei Tage lang in einem befeuchteten Inkubator zur Virusproduktion.
8. Tag 5. Sammeln Sie den Virus und filtrieren Sie ihn durch einen 0,45 mm-Filter mit geringer Proteinbindung. Verwenden Sie den Virus sofort oder portionieren Sie ihn in Einwegaliquots und frieren Sie ihn bei -80 °C ein. Gefrorener pantropischer und ekotropischer Virus sollte nach sechs beziehungsweise einem Monat Lagerung erneut titriert werden.
9. Bestimmen Sie die Virus-Titer wie folgt unter Verwendung von Zellen, die relativ leicht transduzierbar sind. Transduzieren Sie die Zellen über Nacht mit dem fluoreszierenden Kontrollvirus in frischem Medium mit 6 μg/ml PB, wobei serielle Verdünnungen (z. B. 1:10, 1:100, 1:1000) verwendet werden. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch frisches. Geben Sie den Zellen zwei Tage nach der Transduktion Zeit, um das fluoreszierende Protein zu exprimieren, und bestimmen Sie dann den Anteil transduzierter Zellen mittels FACS. Berechnen Sie den Titer in transduzierenden Einheiten (TU) pro ml basierend auf Verdünnungen, die < 15 % Transduktion ergeben, um Mehrfachtransduktionen zu minimieren.
   

2. Transduktion menschlicher Zielzellen mit dem murinen Retrovirusrezeptor Slc7a1

1. Wählen Sie eine Multiplizität der Infektion (MOI) = 2, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen transduziert werden. Für Zielzellen, die resistent gegenüber der Transduktion sind, wie beispielsweise HDFs, ist eine höhere MOI erforderlich; wir verdünnen das virale Überstandmedium lediglich 1:2, um eine Transduktion des Großteils der Zellen zu erreichen.
2. Transduzieren Sie die Zielzellen über Nacht mit viralem Überstandmedium, das in frischem Kulturmedium mit 6 μg/ml PB verdünnt wurde, wodurch die Transduktion durch eine Verbesserung der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen dem Virus und der Zielzelle erhöht wird.¹ Idealweise sollte ein minimales Volumen an Virus verwendet werden, beispielsweise 1 ml für eine 35-mm-Platte, da die Diffusion ein limitierender Faktor für die Transduktionseffizienz darstellt.
3. Kultivieren Sie die Zellen mindestens 48 Stunden nach Entfernung des Virus, bevor sie mit ekotropem Virus transduziert werden, um eine ausreichende Expression des Slc7a1-Rezeptors sicherzustellen.
4. (Optional) Falls gewünscht, kann Blasticidin verwendet werden, um stabil transduzierte Zellen, die Slc7a1 exprimieren, auszuwählen. Eine Blasticidin-Tötungskurve sollte im Voraus erstellt werden, um die niedrigste wirksame Konzentration zu bestimmen, die in der Regel zwischen 2 – 10 μg/ml liegt und alle nicht transduzierten Zielzellen innerhalb von 7 Tagen abtötet. Etwa zwei Tage nach der Entfernung des Slc7a1-Virus wechseln Sie die transduzierten Zellen auf Medium, das Blasticidin enthält. Kultivieren Sie die Zellen 7 Tage lang in Blasticidin-haltigem Medium, wodurch alle verbleibenden Zellen den Retrovirusrezeptor stabil exprimieren und anschließend mit ekotropem Virus transduziert sowie als stabile Slc7a1-exprimierende Zelllinie für zukünftige Anwendungen eingelagert werden können.

3. Polymerkomplextitration zur Bestimmung der Toxizität

1. Tag 1. Pflanzen Sie die Zellen mit 5000 Zellen/Vertiefung in eine 96-Loch-Platte, wobei für jede experimentelle Gruppe mindestens drei Vertiefungen vorgesehen werden. Fügen Sie unbehandelte Zellen in komplettem Medium hinzu, um einen Basiswert für gesunde Zellen zu erhalten, sowie Proben mit Zellen in serumfreiem Medium, um eine Wachstumsarrest als Kontrolle zu induzieren. Parallel dazu pflanzen Sie Zellen in einem geeigneten Format (z. B. 24-Loch-Platte) für die mikroskopische oder FACS-basierte Analyse der Transduktionseffizienz unter jeder experimentellen Bedingung.
2. Tag 2. Transduzieren Sie die Zellen in den für die MTT- und FACS-Analysen vorbereiteten Platten mit einem Virus, das GFP kodiert, bei einem MOI von 0,5, um etwa 40 % der Zielzellen zu transduzieren. Testen Sie verschiedene Konzentrationen von CS/PB (z. B. 50, 100, 200, 400, 600 und 800 mg/ml je Komponente) sowie 6 μg/ml PB, um die optimalen Mengen zu bestimmen. Stellen Sie die Polymerkomplexe wie in Teil 4 beschrieben her.
3. Tag 3. Entfernen Sie das virushaltige Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Stellen Sie die Platten zurück in einen befeuchteten Inkubator.
4. Tag 5. Analysieren Sie die FACS-Platte, um die Transduktionseffizienz bei jeder Polymerkonzentration zu bestimmen.
5. Tag 6. Entfernen Sie das Medium aus allen Vertiefungen der MTT-Platte und ersetzen Sie es durch 100 μl MTT-Lösung (1 mg/ml MTT in komplettem Medium). Inkubieren Sie drei Stunden in einem befeuchteten Inkubator, damit das MTT in den Mitochondrien metabolisch aktiver Zellen reduziert werden kann.
6. Entfernen Sie die MTT-Lösung und ersetzen Sie sie durch 200 μl MTT-Lösungsmittel (0,1 N HCl, 0,1 % Igepal CA-630 in Isopropanol).
7. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur oder bis der violette MTT-Formazan-Niederschlag vollständig gelöst ist. Messen Sie die Absorption mit einem Mikroplatten-Reader bei 570 nm, wobei die Hintergrundabsorption bei 690 nm subtrahiert wird.
8. Wählen Sie die optimale Polymerkonzentration aus, die gemäß FACS die maximale Steigerung der Transduktion bewirkt und gleichzeitig gemäß MTT einen minimalen Einfluss auf die metabolische Aktivität aufweist. Für HDFs wählten wir basierend auf den unten gezeigten repräsentativen Ergebnissen 100 μg/ml CS/PB.

4. Ekotrope Transduktion mit Polymerkomplexierung

1. Stellen Sie sterile gefilterte Stammlösungen von PB und Chondroitinsulfat in einer Konzentration von 20 mg/ml in Wasser her. Portionieren Sie die Lösungen und lagern Sie sie bei -20°C.
2. Pipettieren Sie das virale Überstandmedium in ein Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie es mit frischem Kulturmedium auf die gewünschte Endkonzentration (z. B. MOI von 2). Geben Sie nacheinander gleiche Volumina von PB und Chondroitinsulfat (Konzentrationen wie in Schritt 3 oben bestimmt) hinzu, wobei das Röhrchen nach jeder Zugabe durch leichtes Anschlagen gemischt wird. Die virale Mischung wird sofort trüb, da sich Präzipitate bilden. Inkubieren Sie die virale Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Bildung der Komplexe zu ermöglichen.
3. Entfernen Sie das Medium von den Zielzellen, die das Rezeptorprotein exprimieren, ersetzen Sie es durch die virale Mischung und inkubieren Sie über Nacht bei 37°C und 5% CO2. Nach der Entfernung der viralen Mischung waschen Sie die Zelloberfläche zweimal mit PBS, um verbliebene Viruskomplexe zu entfernen. Eine vollständige Entfernung ist nicht erforderlich; wir haben keine nachteiligen Auswirkungen auf die Zellgesundheit durch restliche Polymerkomplexe beobachtet.

5. Überprüfung der Spezifität der ektropen Transduktion

1. Wenn zum ersten Mal ekotroper Virus hergestellt wird, ist es aus Sicherheitsgründen ratsam, zu überprüfen, ob der Virus keine unveränderten menschlichen Zellen transduzieren kann. Transduzieren Sie menschliche Zellen über Nacht mit ekotropem Lentivirus in relativ hoher Konzentration (nur eine 1- bis 2-fache Verdünnung des viralen Überstandes in frischem Medium) in Gegenwart von 6 μg/ml PB oder der optimierten CS/PB-Konzentration.
2. Entfernen Sie das virushaltige Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Nach einer zweitägigen Inkubation überprüfen Sie die Expression des Transgens mittels FACS unter Verwendung fluoreszierender Vektoren und/oder mittels RT-PCR mit transgenspezifischen Primern.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1A zeigt den Prozess der Lentivirus-Produktion, und Abbildung 1B zeigt die Transduktion menschlicher Zellen mit ekotropem Lentivirus, einschließlich der Prätransduktion mit dem murinen Retrovirusrezeptor Slc7a1. Zur Bestimmung der Virus-Titer verwenden wir eine humane Rhabdomyosarkom-Zelllinie, die stabil mit Slc7a1 transduziert wurde (Slc-hRMS). Bei Verwendung fluoreszierender Kontrollvektoren zur Überwachung der Transduktionseffizienz erreichen wir routinemäßig eine Transduktionseffizienz von > 90 % von Slc-hRMS mit ekotropem Virus, wie in Abbildung 2A und 2B dargestellt. Die Transduktionsraten von HDFs sind in der Regel niedriger, da die Zellen nicht mittels Blasticidin auf Rezeptorexpression selektiert wurden (Abbildung 2C). Die Titer ekotroper Lentiviren liegen in der Regel bei 10–20 % derer von VSV-pseudotypisierten Viren, wenn sie an Slc-hRMS gemessen werden (Abbildung 2D).

Ein einziger Gefrier-Tau-Zyklus verringert den Titer des ekotropen Virus um 16 – 3 %, was dem Titerverlust während eines einzelnen Gefrier-Tau-Zyklus des mit VSV pseudotypisierten Virus entspricht (p > 0,05). Im Gegensatz zu früheren Berichten² beobachten wir keine positive Wirkung auf den Virustiter durch Schnellgefrieren in Trockeneis. Stattdessen erzielen wir höhere Titer nach dem Auftauen für beide Pseudotypen, indem wir die Virusproben einfach in einen -80 °C-Tiefkühler stellen (Daten nicht gezeigt).

Der MTT-Vitalitätsassay ermöglicht den empfindlichen Nachweis von Wachstumsarrest in Zielzellen. Die Transduktion mit Virus in Kombination mit Konzentrationen von CS/PB bis zu 800 μg/ml hat keinen Einfluss auf den Stoffwechsel von HDFs (Abb. 3A). Die Exposition gegenüber CS/PB ohne Virus zeigt ebenfalls keine toxische Wirkung auf die Zellen (Daten nicht gezeigt). Die FACS-Analyse von HDFs, die mit Virus und verschiedenen Konzentrationen von CS/PB transduziert wurden, zeigt eine Verbesserung der Transduktion im Vergleich zu PB allein (Abb. 3B). Die maximale Steigerung tritt bei 100 μg/ml CS/PB auf (Abb. 3C), mehrfach niedriger als zuvor berichtete Werte.³ Daher ist es wichtig, die Bedingungen für jeden gegebenen Zelltyp zu optimieren.

Die Komplexierung mit CS/PB erhöht den beobachteten Titer im Slc-hRMS um etwa das Dreifache (Abb. 4A, p < 0,01). Praktisch führt dies bei niedrigen Virus-Konzentrationen zu einer stärkeren Wirkung auf die Transduktionseffizienz als bei höheren Konzentrationen (Abb. 4B), was höchstwahrscheinlich auf mehrfach transduzierte Zellen und eine Sättigung der Rezeptoren bei höheren Virus-Konzentrationen zurückzuführen ist.

Die Transduktion mit ekotropem Virus ist spezifisch für Zellen, die den murinen Retrovirusrezeptor exprimieren. Bei der Transduktion unveränderter menschlicher Zellen mit ekotropem Virus haben wir unabhängig von der Verwendung von PB oder CS/PB keine Fluoreszenz beobachtet, die über die unbehandelte Hintergrundfluoreszenz hinausgeht, wie in Abbildung 5A dargestellt. Mikroskopisch zeigen humane Dermal-Fibroblasten (HDFs) keine Transduktion in Abwesenheit des Rezeptors (Abbildung 5B), während vorherige Transduktion mit dem Rezeptor zu fluoreszierenden Zellen führt (Abbildung 5C).

Abbildung 1. Schematische Darstellung von (A) dem Virusproduktionsprozess und (B) der Transduktion menschlicher Zellen mit murinem Retrovirusrezeptor, gefolgt von einem ekotropen Lentivirus.

Abbildung 2. Hochgradige Transduktion menschlicher Zellen mit ektropem Lentivirus, das GFP kodiert. Die Zellen wurden zuvor mit dem murinen Retrovirusrezeptor Slc7a1 transduziert. (A) Menschliche Rhabdomyosarkom-Zelllinie, die mittels Blasticidin für Slc7a1 ausgewählt wurde (Slc-hRMS), transduziert (blau) oder nicht transduziert (rosa) mit GFP. (B) Fluoreszenzmikrografie von ektrop transduzierten Slc-hRMS-Zellen (4X). (C) HDFs, transduziert (blau) und nicht transduziert (rosa) mit ektropem GFP-Lentivirus; die Zellen wurden zwei Tage vor der ektropen Transduktion mit Slc7a1 transduziert. (D) Titer von VSV-G-Pseudotyp- und ektropem Lentivirus, gemessen an Slc-hRMS.

Abbildung 3. Optimierung der Chondroitinsulfat/Polybrene (CS/PB)-Konzentrationen in humanen dermalen Fibroblasten. (A) Vitalität von HDFs, gemessen mittels MTT-Assay nach Transduktion in Anwesenheit von alleinigem PB oder variierenden Konzentrationen von CS/PB. (B) Steigerung der Transduktionseffizienz in HDFs durch unterschiedliche CS/PB-Konzentrationen, gemessen mittels FACS. (C) Quantifizierung der Transduktionssteigerung, die zeigt, dass die maximale Transduktion bei 100 μg/ml CS/PB auftritt.

Abbildung 4. Einfluss von 400 μg/ml CS/PB auf die Transduktion von Slc-hRMS mit ekotropem Lentivirus. (A) Titerverbesserung und (B) Veränderung der Transduktionsrate im Vergleich zu 6 μg/ml Polybrene allein.

Abbildung 5. Fehlende ektotrope Transduktion von HDFs in Abwesenheit des murinen Retrovirusrezeptors Slc7a1. (A) FACS-Diagramm von BJ-Menschlichen Fibroblasten, nicht transduziert (pink) oder transduziert (blau) mit ektropem GFP-Lentivirus, jeweils in Abwesenheit des Rezeptors Slc7a1. BJ-Menschliche Fibroblasten, transduziert mit ektropem GFP-Lentivirus, ohne (B) und mit (C) vorheriger Transduktion mit dem Rezeptor Slc7a1 (4X).

Diskussion

Rekombinante ecotropen gammaretrovirus auf Moloney Maus-Leukämie-Virus (MLV) und sein Rezeptor mSlc7a1 Basis sind gut untersucht und überall erhältlich, mit mehr als 20 Jahren verwendet worden, um Transgenen auf murine Zellen liefern. Ecotropen gammaretrovirus wurde auch in jüngerer Zeit, um Onkogene, menschliche Zellen zu liefern verwendet;. Im Rahmen der Reprogrammierung, die Verwendung von mSlc7a1 zu Generation amphotropen Virus beherbergen menschlichen Onkogene zu vermeiden, ist gut etabliert ^4,5 Allerdings sieht Lentivirus erhebliche Vorteile gegenüber gammaretrovirus in transduzierenden feuerfesten Zellpopulationen, ⁶ einschließlich Primärzellen, die oft wünschenswert, Ziele für die Neuprogrammierung, weil die lentiviralen Präintegrationskomplexes ermöglicht Transduktion von nicht-teilenden Zellen. ⁷

Lentiviren haben mit Dutzenden von verschiedenen Pseudotypen, einschließlich MLV, in dem Bemühen, Virus Tropismus, Toxizität und andere Eigenschaften. ⁸ MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus wurde verwendet, um Zellen der Maus, ⁹ transduzieren, hat aber nur selten auf menschliche Zellen verwendet worden verändern produziert . ¹⁰ Wir schlagen daher die Verwendung von MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus als eine sichere, kostengünstige und hocheffiziente Fahrzeug bekannter oder vermuteter Onkogene, einschließlich der Reprogrammierung Faktoren, die menschliche Zellen zu liefern.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll nicht vollständig beseitigen die Notwendigkeit zu produzieren und zu nutzen pantropic Lentivirus, sondern trennt dieses Protokoll das Onkogen (s) aus dem pantropic Virus, isolierende Forscher vor möglichen Selbst-Impfung mit dem Krebs-verwandten Viren. Das Protein mSlc7a1 und seine menschliche Homolog hSlc7a1 sind ubiquitär Aminosäure-Transporter ohne bekannte Tumorigenität oder Fähigkeit, ein selektives Wachstum Vorteil Empfänger-Zellen übertragen, ¹¹ machen mSlc7a1 von relativ geringem Risiko für den Einbau in amphotrope Virus exprimiert. Dieser zusätzliche Schritt kann besonders nützlich in Labors fehlen gewidmet Virus oder Gewebekultur Einrichtungen der erforderlichen Sicherheitsstufe.

In manchen Situationen kann es möglich sein, vollständig zu eliminieren die Verwendung von pantropic Virus durch Transfektion der Slc7a1 Plasmid direkt in Zielzellen, jedoch sind viele Zellen, die nützliche Ziele dieser Technik werden auch feuerfeste der Transfektion. Als Alternative, die Fähigkeit zu isolieren Slc7a1-transduzierten Zellen durch Blasticidin Auswahl bedeutet, dass VSV-G pseudotypisiert Lentivirus einmal verwendet werden kann, um einen Bestand von Rezeptor-exprimierenden Zellen, nach denen ecotropen Virus routinemäßig eingesetzt werden können, um diese Zellen für viele transduzieren generieren Experimente. Forscher sollten immer nach ihrer institutionellen Sicherheit Richtlinien für die Arbeit mit einem Lentivirus, unabhängig von ihrer Tropismus.

Titer ecotropen Virus mit diesem Protokoll erreicht werden moderat niedriger als VSV-pseudotypisiert Virus, in der Regel 10-20% des pantropic Virustiter, in Übereinstimmung mit früheren Studien. ⁹ Diese Titer in menschlichen Zellen wurden gemessen stabil transduzierten mit Slc7a1, so dass die unteren beobachtet Titer für ecotropen Virus kann teilweise durch vielseitige Ausdruck der Rezeptor-Gen in die Zielzellen. Dennoch sind die viralen Titer in unserem Protokoll erreicht mehr als ausreichend für die meisten Anwendungen und führen zu Transduktion der Mehrzahl der Zellen, in einigen Fällen> 90% der Zellen.

Centrifugation-basierte Techniken werden häufig verwendet, um virale Partikel zu konzentrieren. Allerdings erfordert Zentrifugation mehrere Stunden, erzeugt infektiöse Aerosole, und kann zu einem erheblichen Verlust der viralen Partikel führen. ¹² Als Alternative Komplexierung mit CS / PB kann zur Transduktion ohne dass virale Tropismus zu verbessern. ³ Diese Methode ist schnell (5 Minuten ) und preisgünstig ($ 0,03 pro 10 ml-Virus), während etwa einer Verdreifachung der beobachteten Titer. Keine besondere Ausrüstung oder proprietären Reagenzien erforderlich sind, und wir beobachteten minimal akuten Toxizität nach der Exposition des HDF zu CS / PB, in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten in anderen Zelllinien. ¹³ Ein potenzieller Nachteil dieses Protokolls ist, dass einige mikroskopisch sichtbare Polymer-Komplexe zu halten die Zellen für mehrere Tage in Kultur. Wir können nicht ausschließen, dass diese Komplexe, die zwar nicht offen toxisch auf die Zellen, können subtilere Effekte auf zellulärer Prozesse haben.

Hier haben wir eine Methodik zur sicheren und effizienten Transduktion humaner Zellen mit onkogenen Faktoren beschrieben. Dieser Ansatz sollte von großem Nutzen für Forscher studieren Onkogene und Stammzellbiologie einschließlich iPS-Zellen sein.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murine MLV-Rezeptor
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G Umschlag
pCMV-dR8.91	D. Trono Labor 14		Packaging-Plasmid (entspricht Plasmid psPax2 ist ab Addgene, Cat. Anzahl 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropen Umschlag
FUGW	Addgene	14883	GFP Kontroll-Plasmid
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrinbromid (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Chondroitinsulfat Natriumsalz aus Haifischknorpel	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Fischer	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021