Methodenartikel

Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety

17.5K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/2822

⸱

24. Juli 2011

 , 
1Department of Cell Biology and Human Anatomy, School of Medicine, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Lentiviren sind eine wertvolle Recherche-Tool für die Erkundung der Genfunktion, aber Forscher möge Produktion von pantropic Lentivirus Kodierung bekannten oder vermuteten Onkogene zu vermeiden. Als Alternative stellen wir ein sicheres Protokoll für die Verwendung von ecotropen Lentivirus auf menschliche Zellen geändert, um die ecotropen Rezeptor mSlc7a1 auszudrücken.

Zusammenfassung

Stamm-und Tumor-Zellbiologie Studien erfordern häufig virale Transduktion humaner Zellen mit bekannter oder vermuteter Onkogene, Erhöhung wichtigen Fragen der Sicherheit für das Laborpersonal. Pantropic Lentiviren, wie die häufig verwendeten VSV-G Pseudotyp, sind ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion, weil sie vielen Zelltypen, einschließlich nicht-teilenden Zellen transduzieren. Allerdings können Forscher wollen Produktions-und Zentrifugation pantropic Viren kodieren Onkogene durch höhere Sicherheitsstufe Umgang mit Anforderungen und Fragen der Sicherheit zu vermeiden. Mehrere starke Onkogene, einschließlich c-Myc und SV40 large T-Antigen, sind bekannt, die Produktion von induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSC) zu verbessern. Alle anderen bekannten iPSC-induzierenden genetischen Veränderungen (Oct4, Sox2, Klf4, NANOG, LIN28 und p53 Verlust der Funktion) auch Links zu Krebs, so dass sie relativ hoher Sicherheit betreffen, sowie.

Während diese im Zusammenhang mit Krebs Viren nützlich beim Studium der Reprogrammierung und Pluripotenz sind, müssen sie sicher verwendet werden. Um diese Fragen der biologischen Sicherheit, zeigen wir eine Methode zur Transduktion humaner Zellen mit ecotropen Lentivirus, mit zusätzlichem Schwerpunkt auf reduzierte Kosten und eine bequeme Handhabung. Wir haben ecotropen Lentivirus mit einer ausreichend hohen Titer produziert, um mehr als 90% der transduzieren-Rezeptor-exprimierenden menschlichen Zellen mit dem Virus, der Validierung der Wirksamkeit dieses Ansatzes.

Lentivirus ist oft durch Ultrazentrifugation konzentriert, allerdings dauert dieser Vorgang mehrere Stunden und kann Aerosole Infektionskrankheiten des Menschen biomedizinische Forscher produzieren. Als Alternative, virale Partikel können mehr sicher auf Zellen werden durch Komplexierung mit Chondroitinsulfat und Polybren (CS / PB) sedimentiert. Diese Technik erhöht die funktionelle virale Titer von bis zu 3-fach in den Zellen stabil exprimieren Mäuse-Retrovirus-Rezeptor, mit vernachlässigbaren zusätzlichen Zeit-und Kosten. Transduktion von humanen dermalen Fibroblasten (HDF) ist maximal erweitert mit CS / PB-Konzentrationen etwa 4-fach niedriger als der optimale Wert zuvor für Krebszelllinien gemeldet, was darauf hindeutet, dass Polymer-Konzentration für die Zielzelle Art der Verzinsung sollte titriert werden. Deshalb beschreiben die Verwendung von methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid (MTT) zum Testen auf Polymer-Toxizität in einem neuen Zelltyp. Wir beobachten, entspricht Lebensfähigkeit der HDF nach einer viralen Transduktion entweder mit Polymer-Komplexierung oder der Standard-Dosierung von Polybren (PB, 6 pg / ml), was darauf hinweist minimal akute Toxizität.

In diesem Protokoll, beschreiben wir die Verwendung von ecotropen Lentivirus für die Überexpression von Onkogenen in menschlichen Zellen, wodurch die biologische Sicherheit Risiken und die Erhöhung der Transduktion Rate. Wir zeigen auch die Verwendung von Polymer-Komplexierung Transduktion zu verbessern und gleichzeitig die Vermeidung aerosolbildende Zentrifugation von Viruspartikeln.

Protokoll

1. Produktion, Gewinnung und Einfrieren von Lentiviren

  1. Konsultieren Sie vor Beginn dieses Protokolls Ihren institutionellen Sicherheitsbeauftragten und befolgen Sie die empfohlenen Sicherheitsrichtlinien.
  2. Tag 1. Beginnen Sie mit gesunden, schnell wachsenden 293T-Zellen zur Virusproduktion. Säen Sie die Zellen mit 5 x 106 Zellen pro 10 cm-Platte aus. Verwenden Sie antibiotikafreies 293T-Medium (DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % FBS und 4 mM L-Glutamin) für die Virusproduktion.
  3. Tag 2. Transfizieren Sie am späten Nachmittag die 293T-Zellen wie folgt (Angaben beziehen sich auf eine 10 cm-Platte). Lassen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmen. Pipettieren Sie 375 μl OptiMEM in ein Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie dann 25 μl Fugene HD hinzu. Vermeiden Sie, dass unverdünntes Fugene die Röhrchenoberfläche berührt.
  4. Mischen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen:
    • 5 μg Transferplasmid (Slc7a1, Zielvektor oder fluoreszierender Kontrollvektor)
    • 3,75 μg Verpackungsplasmid (pCMV-dR8.91 oder psPax2)
    • 1,25 μg Hüllplasmid (pMD2.G für pantropisch, pHCMV-EcoEnv für ekotropisch)
    • serumfreies OptiMEM auf ein Gesamtvolumen von 100 μl
  5. Vereinigen Sie die Inhalte beider Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung 20–30 Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Ersetzen Sie das Medium der 293T-Zellen durch 10 ml frisches, antibiotikafreies 293T-Medium. Geben Sie die Fugene/Plasmid-Mischung tropfenweise auf die Zellen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2.
  7. Tag 3. Ersetzen Sie das Medium der 293T-Zellen durch 10 ml frisches, antibiotikafreies 293T-Medium. Arbeiten Sie vorsichtig, da die 293T-Zellen nur locker haften und durch zu starkes Aufpipettieren des Mediums von der Zellschicht abgelöst werden können. Inkubieren Sie zwei Tage lang in einem befeuchteten Inkubator zur Virusproduktion.
  8. Tag 5. Sammeln Sie den Virus und filtrieren Sie ihn durch einen 0,45 mm-Filter mit geringer Proteinbindung. Verwenden Sie den Virus sofort oder portionieren Sie ihn in Einwegaliquots und frieren Sie ihn bei -80 °C ein. Gefrorener pantropischer und ekotropischer Virus sollte nach sechs beziehungsweise einem Monat Lagerung erneut titriert werden.
  9. Titrieren Sie den Virus wie folgt unter Verwendung von Zellen, die relativ leicht transduzierbar sind. Transduzieren Sie die Zellen über Nacht mit dem fluoreszierenden Kontrollvirus in frischem Medium mit 6 μg/ml PB, wobei serielle Verdünnungen (z. B. 1:10, 1:100, 1:1000) verwendet werden. Wechseln Sie am nächsten Tag auf frisches Medium. Geben Sie den Zellen zwei Tage nach der Transduktion Zeit, um das fluoreszierende Protein zu exprimieren, und bestimmen Sie dann den Anteil transduzierter Zellen mittels FACS. Berechnen Sie die Titerangabe in Transformations-Einheiten (TU) pro ml, basierend auf Verdünnungen, die < 15 % Transduktion ergeben, um Mehrfachtransduktionen zu minimieren.
    Formel zur Titerberechnung, Gleichung zur Virusquantifizierung, mathematische Analyse in der Virologie.

2. Transduktion menschlicher Zielzellen mit dem murinen Retrovirusrezeptor Slc7a1

  1. Wählen Sie eine Multiplizität der Infektion (MOI) = 2, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen transduziert werden. Für Zielzellen, die resistent gegen die Transduktion sind, wie beispielsweise HDFs, ist eine höhere MOI erforderlich; wir verdünnen das virale Überstandmedium lediglich im Verhältnis 1:2, um eine Transduktion der Mehrheit der Zellen zu erreichen.
  2. Transduzieren Sie die Zielzellen über Nacht mit viralem Überstandmedium, das in frischem Kulturmedium mit 6 μg/ml PB verdünnt wurde, wodurch die Transduktion durch Verstärkung der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen Virus und Zielzelle erhöht wird.1 Idealerweise sollte ein minimales Volumen an Virus verwendet werden, beispielsweise 1 ml für eine 35-mm-Platte, da die Diffusion ein limitierender Faktor für die Transduktionseffizienz ist.
  3. Kultivieren Sie die Zellen mindestens 48 Stunden nach Entfernung des Virus, bevor sie mit einem ektropen Virus transduziert werden, um eine ausreichende Expression des Slc7a1-Rezeptors sicherzustellen.
  4. (Optional) Falls gewünscht, kann Blasticidin verwendet werden, um stabil transduzierte Zellen, die Slc7a1 exprimieren, auszuwählen. Eine Blasticidin-Tötungskurve sollte im Voraus erstellt werden, um die niedrigste wirksame Konzentration zu bestimmen, die in der Regel zwischen 2 – 10 μg/ml liegt und alle nicht transduzierten Zielzellen innerhalb von 7 Tagen abtötet. Etwa zwei Tage nach Entfernung des Slc7a1-Virus wechseln Sie die transduzierten Zellen auf Medium, das Blasticidin enthält. Kultivieren Sie die Zellen 7 Tage lang in Blasticidin-haltigem Medium, wodurch alle verbliebenen Zellen den Retrovirusrezeptor stabil exprimieren; anschließend können sie mit ektropem Virus transduziert oder für zukünftige Verwendung als stabile Slc7a1-exprimierende Zelllinie eingelagert werden.

3. Polymerkomplex-Titration zur Bestimmung der Toxizität

  1. Tag 1. Zellen in einer Dichte von 5000 Zellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Platte ansäen, wobei für jede experimentelle Gruppe mindestens drei Vertiefungen vorzusehen sind. Fügen Sie nicht transduzierte Zellen in komplettem Medium hinzu, um einen Basiswert für gesunde Zellen zu erhalten, sowie Proben mit Zellen in serumfreiem Medium, um eine Wachstumshemmung als Kontrolle zu induzieren. Parallel dazu Zellen in einem geeigneten Format (z. B. 24-Loch-Platte) für die mikroskopische oder FACS-basierte Analyse der Transduktionseffizienz unter jeder experimentellen Bedingung ansäen.
  2. Tag 2. Transduzieren Sie die Zellen in den für die MTT- und FACS-Analysen vorbereiteten Platten mit einem Virus, das GFP kodiert, bei einem MOI von 0,5, um etwa 40 % der Zielzellen zu transduzieren. Testen Sie verschiedene Konzentrationen von CS/PB (z. B. 50, 100, 200, 400, 600 und 800 mg/ml je Komponente) sowie 6 μg/ml PB, um die optimalen Mengen zu bestimmen. Stellen Sie die Polymerkomplexe wie in Teil 4 unten beschrieben her.
  3. Tag 3. Entfernen Sie das virushaltige Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Stellen Sie die Platten wieder in einen befeuchteten Inkubator.
  4. Tag 5. Analysieren Sie die FACS-Platte, um die Transduktionseffizienz bei jeder Polymerkonzentration zu bestimmen.
  5. Tag 6. Entfernen Sie das Medium aus allen Vertiefungen der MTT-Platte und ersetzen Sie es durch 100 μl MTT-Lösung (1 mg/ml MTT in komplettem Medium). Inkubieren Sie drei Stunden in einem befeuchteten Inkubator, um die Reduktion von MTT in den Mitochondrien metabolisch aktiver Zellen zu ermöglichen.
  6. Entfernen Sie die MTT-Lösung und ersetzen Sie sie durch 200 μl MTT-Lösungsmittel (0,1 N HCl, 0,1 % Igepal CA-630 in Isopropanol).
  7. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur oder bis sich der gesamte violette MTT-Formazan-Niederschlag aufgelöst hat. Messen Sie die Extinktion mit einem Mikroplatten-Reader bei 570 nm, wobei die Hintergrundabsorption bei 690 nm subtrahiert wird.
  8. Wählen Sie die optimale Polymerkonzentration aus, die gemäß FACS die maximale Steigerung der Transduktionseffizienz bewirkt und gleichzeitig gemäß MTT nur minimale Auswirkungen auf die metabolische Aktivität hat. Für HDFs wählten wir basierend auf den unten dargestellten repräsentativen Ergebnissen 100 μg/ml CS/PB.

4. Ekotrope Transduktion mit Polymerkomplexierung

  1. Stellen Sie sterile gefilterte Stammlösungen von PB und Chondroitinsulfat in Wasser mit einer Konzentration von 20 mg/ml her. Portionieren und lagern Sie diese bei -20°C.
  2. Pipettieren Sie das virale Überstandmedium in ein Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie es mit frischem Kulturmedium auf die gewünschte Endkonzentration (z. B. MOI von 2). Geben Sie nacheinander gleiche Volumina von PB und Chondroitinsulfat (Konzentrationen wie in Schritt 3 oben bestimmt) hinzu und schwenken Sie das Röhrchen leicht nach jeder Zugabe, um zu mischen. Die Virusmischung wird sofort trüb, da sich Präzipitate bilden. Inkubieren Sie die Virusmischung 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Komplexbildung zu ermöglichen.
  3. Entfernen Sie das Medium von den Zielzellen, die den Rezeptor exprimieren, ersetzen Sie es durch die Virusmischung und inkubieren Sie über Nacht bei 37°C und 5% CO2. Nach der Entfernung der Virusmischung waschen Sie die Zelloberfläche zweimal mit PBS, um verbliebene Viruskomplexe zu entfernen. Eine vollständige Entfernung ist nicht erforderlich; wir haben keine nachteiligen Auswirkungen auf die Zellgesundheit durch verbliebene Polymerkomplexe beobachtet.

5. Überprüfung der Spezifität der ekotropen Transduktion

  1. Wenn zum ersten Mal ein ektropischer Virus hergestellt wird, ist es aus Sicherheitsgründen ratsam, zu überprüfen, ob der Virus nicht in der Lage ist, nicht modifizierte menschliche Zellen zu transduzieren. Transduzieren Sie menschliche Zellen über Nacht mit ektropischem Lentivirus in relativ hoher Konzentration (nur eine 1- bis 2-fache Verdünnung des viralen Überstandes in frischem Medium) in Gegenwart von 6 μg/ml PB oder der optimierten CS/PB-Konzentration.
  2. Entfernen Sie das virushaltige Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Nach einer Inkubation der Zellen für 2 Tage überprüfen Sie die Expression des Transgens mittels FACS unter Verwendung fluoreszierender Vektoren und/oder mittels RT-PCR mit transgenspezifischen Primern.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Abb. 1A zeigt den Prozess der Lentivirus-Produktion, und Abb. 1B zeigt die Transduktion menschlicher Zellen mit ektropem Lentivirus, einschließlich der Vorbehandlung mit dem murinen Retrovirus-Rezeptor Slc7a1. Zur Bestimmung der Virus-Titrierung verwenden wir eine humane Rhabdomyosarkom-Zelllinie, die stabil mit Slc7a1 transduziert wurde (Slc-hRMS). Bei Verwendung fluoreszierender Kontrollvektoren zur Überwachung der Transduktionseffizienz erreichen wir routinemäßig eine Transduktionseffizienz von > 90 % der Slc-hRMS-Zellen mit ektropem Virus, wie in Abb. 2A und 2B dargestellt. Die Transduktionsraten von HDFs sind in der Regel niedriger, da die Zellen nicht mittels Blasticidin für die Rezeptor-Expression selektiert wurden (Abb. 2C). Die Titer ektroper Lentiviren betragen in der Regel 10–20 % derjenigen von VSV-pezotypisierten Viren, gemessen an Slc-hRMS (Abb. 2D).

Ein einziger Gefrier-Tau-Zyklus verringert den Titer des ekotropen Virus um 16 – 3 %, was dem Titerverlust während eines einzelnen Gefrier-Tau-Zyklus des mit VSV pseudotypisierten Virus entspricht (p > 0,05). Im Gegensatz zu früheren Berichten2 beobachten wir keine positive Wirkung des Schnellgefrierens in Trockeneis auf den Virustiter. Stattdessen erzielen wir höhere Titer nach dem Auftauen für beide Pseudotypen, indem wir die Virusproben einfach in einen -80 °C-Tiefkühler stellen (Daten nicht gezeigt).

Der MTT-Vitalitätsassay ermöglicht den empfindlichen Nachweis von Wachstumsarrest in Zielzellen. Die Transduktion mit Virus sowie Konzentrationen von CS/PB bis zu 800 μg/ml hat keinen Einfluss auf den Stoffwechsel von HDFs (Abb. 3A). Die Exposition gegenüber CS/PB ohne Virus zeigt ebenfalls keine toxische Wirkung auf die Zellen (Daten nicht gezeigt). Die FACS-Analyse von HDFs, die mit Virus und verschiedenen Konzentrationen von CS/PB transduziert wurden, zeigt eine Verbesserung der Transduktion im Vergleich zu PB allein (Abb. 3B). Die maximale Steigerung tritt bei 100 μg/ml CS/PB auf (Abb. 3C), mehrfach niedriger als zuvor berichtete Werte.3 Daher ist es wichtig, die Bedingungen für jeden gegebenen Zelltyp zu optimieren.

Die Komplexierung mit CS/PB erhöht den beobachteten Titer im Slc-hRMS um etwa das Dreifache (Abb. 4A, p < 0,01). In der Praxis führt dies bei niedrigen Virus-Konzentrationen zu einer stärkeren Wirkung auf die Transduktionseffizienz als bei höheren Konzentrationen (Abb. 4B), was höchstwahrscheinlich auf mehrfach transduzierte Zellen und eine Sättigung der Rezeptoren bei höheren Virus-Konzentrationen zurückzuführen ist.

Die Transduktion mit ekotropem Virus ist spezifisch für Zellen, die den murinen Retrovirusrezeptor exprimieren. Bei der Transduktion nicht modifizierter menschlicher Zellen mit ekotropem Virus beobachteten wir keine Fluoreszenz, die über der unbehandelten Hintergrundfluoreszenz lag, unabhängig davon, ob PB oder CS/PB verwendet wurde, wie in Abbildung 5A dargestellt. Mikroskopisch zeigen humane Dermal-Fibroblasten (HDFs) keine Transduktion in Abwesenheit des Rezeptors (Abbildung 5B), während nach vorheriger Transduktion mit dem Rezeptor fluoreszierende Zellen sichtbar werden (Abbildung 5C).

Schema des Lentivirus-Produktionsprozesses mit Darstellung der Transduktion von 293T-Zellen und der Stadien des viralen Überstandes.
Abbildung 1. Schematische Darstellung von (A) dem Virusproduktionsprozess und (B) der Transduktion menschlicher Zellen mit murinem Retrovirusrezeptor, gefolgt von einem ektropen Lentivirus.

Durchflusszytometrie-Diagramme, Analyse des Anteils GFP-positiver Zellen, Fluoreszenzmikroskopie, Balkendiagramm zur Virus-Titrierung.
Abbildung 2. Hochgradig effiziente Transduktion menschlicher Zellen mit ektropem Lentivirus, das GFP kodiert. Die Zellen wurden zuvor mit dem murinen Retrovirusrezeptor Slc7a1 transduziert. (A) Menschliche Rhabdomyosarkom-Zelllinie, die mittels Blasticidin auf Slc7a1 selektiert wurde (Slc-hRMS), transduziert (blau) oder nicht transduziert (rosa) mit GFP. (B) Fluoreszenzmikrografie von ektrop transduzierten Slc-hRMS-Zellen (4fache Vergrößerung). (C) HDFs, transduziert (blau) und nicht transduziert (rosa) mit ektropem GFP-Lentivirus; die Zellen wurden zwei Tage vor der ektropen Transduktion mit Slc7a1 transduziert. (D) Titer von VSV-G-pseudotypisiertem und ektropem Lentivirus, gemessen an Slc-hRMS-Zellen.

Einfluss der Polymerkonzentration auf die GFP-Expression; Diagramme zu Absorbanz, Durchflusszytometrie und GFP-Anteil.
Abbildung 3. Optimierung der Chondroitinsulfat/Polybrene (CS/PB)-Konzentrationen in humanen dermalen Fibroblasten. (A) Lebensfähigkeit von HDFs, gemessen mittels MTT-Assay nach Transduktion in Gegenwart von alleinigem PB oder unterschiedlichen Konzentrationen von CS/PB. (B) Steigerung der Transduktionseffizienz in HDFs durch verschiedene Konzentrationen von CS/PB, gemessen per FACS. (C) Quantifizierung der Steigerung der Transduktion, die zeigt, dass die maximale Transduktion bei 100 μg/ml CS/PB auftritt.

Gen-Transduktionseffizienz im Vergleich zur Titeranalyse, Balkendiagramm und Streudiagramm, Vergleich des Polybrene-Effekts.
Abbildung 4. Einfluss von 400 μg/ml CS/PB auf die Transduktion von Slc-hRMS mit ekotropem Lentivirus. (A) Titer-Verbesserung und (B) Veränderung der Transduktionsrate im Vergleich zu 6 μg/ml Polybrene allein.

Durchflusszytometrie-GFP-Intensitätsdiagramm mit Fluoreszenzmikroskopieaufnahmen, die die Verteilung von GFP+ Zellen zeigen.
Abbildung 5. Fehlende ektrope Transduktion von HDFs in Abwesenheit des murinen Retrovirusrezeptors Slc7a1. (A) FACS-Diagramm von BJ-Menschlichen Fibroblasten, nicht transduziert (pink) oder transduziert (blau) mit ektropem GFP-Lentivirus, jeweils in Abwesenheit des Rezeptors Slc7a1. BJ-Menschliche Fibroblasten, transduziert mit ektropem GFP-Lentivirus, ohne (B) und mit (C) vorheriger Transduktion mit dem Rezeptor Slc7a1 (4X).

Diskussion

Rekombinante ecotropen gammaretrovirus auf Moloney Maus-Leukämie-Virus (MLV) und sein Rezeptor mSlc7a1 Basis sind gut untersucht und überall erhältlich, mit mehr als 20 Jahren verwendet worden, um Transgenen auf murine Zellen liefern. Ecotropen gammaretrovirus wurde auch in jüngerer Zeit, um Onkogene, menschliche Zellen zu liefern verwendet;. Im Rahmen der Reprogrammierung, die Verwendung von mSlc7a1 zu Generation amphotropen Virus beherbergen menschlichen Onkogene zu vermeiden, ist gut etabliert 4,5 Allerdings sieht Lentivirus erhebliche Vorteile gegenüber gammaretrovirus in transduzierenden feuerfesten Zellpopulationen, 6 einschließlich Primärzellen, die oft wünschenswert, Ziele für die Neuprogrammierung, weil die lentiviralen Präintegrationskomplexes ermöglicht Transduktion von nicht-teilenden Zellen. 7

Lentiviren haben mit Dutzenden von verschiedenen Pseudotypen, einschließlich MLV, in dem Bemühen, Virus Tropismus, Toxizität und andere Eigenschaften. 8 MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus wurde verwendet, um Zellen der Maus, 9 transduzieren, hat aber nur selten auf menschliche Zellen verwendet worden verändern produziert . 10 Wir schlagen daher die Verwendung von MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus als eine sichere, kostengünstige und hocheffiziente Fahrzeug bekannter oder vermuteter Onkogene, einschließlich der Reprogrammierung Faktoren, die menschliche Zellen zu liefern.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll nicht vollständig beseitigen die Notwendigkeit zu produzieren und zu nutzen pantropic Lentivirus, sondern trennt dieses Protokoll das Onkogen (s) aus dem pantropic Virus, isolierende Forscher vor möglichen Selbst-Impfung mit dem Krebs-verwandten Viren. Das Protein mSlc7a1 und seine menschliche Homolog hSlc7a1 sind ubiquitär Aminosäure-Transporter ohne bekannte Tumorigenität oder Fähigkeit, ein selektives Wachstum Vorteil Empfänger-Zellen übertragen, 11 machen mSlc7a1 von relativ geringem Risiko für den Einbau in amphotrope Virus exprimiert. Dieser zusätzliche Schritt kann besonders nützlich in Labors fehlen gewidmet Virus oder Gewebekultur Einrichtungen der erforderlichen Sicherheitsstufe.

In manchen Situationen kann es möglich sein, vollständig zu eliminieren die Verwendung von pantropic Virus durch Transfektion der Slc7a1 Plasmid direkt in Zielzellen, jedoch sind viele Zellen, die nützliche Ziele dieser Technik werden auch feuerfeste der Transfektion. Als Alternative, die Fähigkeit zu isolieren Slc7a1-transduzierten Zellen durch Blasticidin Auswahl bedeutet, dass VSV-G pseudotypisiert Lentivirus einmal verwendet werden kann, um einen Bestand von Rezeptor-exprimierenden Zellen, nach denen ecotropen Virus routinemäßig eingesetzt werden können, um diese Zellen für viele transduzieren generieren Experimente. Forscher sollten immer nach ihrer institutionellen Sicherheit Richtlinien für die Arbeit mit einem Lentivirus, unabhängig von ihrer Tropismus.

Titer ecotropen Virus mit diesem Protokoll erreicht werden moderat niedriger als VSV-pseudotypisiert Virus, in der Regel 10-20% des pantropic Virustiter, in Übereinstimmung mit früheren Studien. 9 Diese Titer in menschlichen Zellen wurden gemessen stabil transduzierten mit Slc7a1, so dass die unteren beobachtet Titer für ecotropen Virus kann teilweise durch vielseitige Ausdruck der Rezeptor-Gen in die Zielzellen. Dennoch sind die viralen Titer in unserem Protokoll erreicht mehr als ausreichend für die meisten Anwendungen und führen zu Transduktion der Mehrzahl der Zellen, in einigen Fällen> 90% der Zellen.

Centrifugation-basierte Techniken werden häufig verwendet, um virale Partikel zu konzentrieren. Allerdings erfordert Zentrifugation mehrere Stunden, erzeugt infektiöse Aerosole, und kann zu einem erheblichen Verlust der viralen Partikel führen. 12 Als Alternative Komplexierung mit CS / PB kann zur Transduktion ohne dass virale Tropismus zu verbessern. 3 Diese Methode ist schnell (5 Minuten ) und preisgünstig ($ 0,03 pro 10 ml-Virus), während etwa einer Verdreifachung der beobachteten Titer. Keine besondere Ausrüstung oder proprietären Reagenzien erforderlich sind, und wir beobachteten minimal akuten Toxizität nach der Exposition des HDF zu CS / PB, in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten in anderen Zelllinien. 13 Ein potenzieller Nachteil dieses Protokolls ist, dass einige mikroskopisch sichtbare Polymer-Komplexe zu halten die Zellen für mehrere Tage in Kultur. Wir können nicht ausschließen, dass diese Komplexe, die zwar nicht offen toxisch auf die Zellen, können subtilere Effekte auf zellulärer Prozesse haben.

Hier haben wir eine Methodik zur sicheren und effizienten Transduktion humaner Zellen mit onkogenen Faktoren beschrieben. Dieser Ansatz sollte von großem Nutzen für Forscher studieren Onkogene und Stammzellbiologie einschließlich iPS-Zellen sein.

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von der California Institute for Regenerative Medicine zur Verfügung gestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
pLenti6/UbC/mSlc7a1 Addgene 17224 Murine MLV-Rezeptor
pMD2.G Addgene 12259 VSV-G Umschlag
pCMV-dR8.91 D. Trono Labor 14 Packaging-Plasmid (entspricht Plasmid psPax2 ist ab Addgene, Cat. Anzahl 12260)
pHCMV-EcoEnv Addgene 15802 Ecotropen Umschlag
FUGW Addgene 14883 GFP Kontroll-Plasmid
OptiMEM Invitrogen 31985
Fugene HD Roche 04 709 705 001
Hexadimethrinbromid (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
Chondroitinsulfat Natriumsalz aus Haifischknorpel Sigma-Aldrich C4384
Blasticidin S Fischer BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid (MTT) Sigma-Aldrich M2128
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021

Referenzen

  1. Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
  2. Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
  3. Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
  4. Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
  5. Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
  6. Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
  7. Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
  8. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
  9. Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
  10. Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
  11. Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
  12. Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
  13. Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
  14. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

PolymerkomplexierungChondroitinsulfatPolybrenevirale TransduktionMTT AssayFluoreszenzmikroskopieFACS AnalyseVerbesserung der Biosicherheithumane dermale Fibroblasten
Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.