Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety

Zusammenfassung

Lentiviren sind eine wertvolle Recherche-Tool für die Erkundung der Genfunktion, aber Forscher möge Produktion von pantropic Lentivirus Kodierung bekannten oder vermuteten Onkogene zu vermeiden. Als Alternative stellen wir ein sicheres Protokoll für die Verwendung von ecotropen Lentivirus auf menschliche Zellen geändert, um die ecotropen Rezeptor mSlc7a1 auszudrücken.

Zusammenfassung

Stamm-und Tumor-Zellbiologie Studien erfordern häufig virale Transduktion humaner Zellen mit bekannter oder vermuteter Onkogene, Erhöhung wichtigen Fragen der Sicherheit für das Laborpersonal. Pantropic Lentiviren, wie die häufig verwendeten VSV-G Pseudotyp, sind ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion, weil sie vielen Zelltypen, einschließlich nicht-teilenden Zellen transduzieren. Allerdings können Forscher wollen Produktions-und Zentrifugation pantropic Viren kodieren Onkogene durch höhere Sicherheitsstufe Umgang mit Anforderungen und Fragen der Sicherheit zu vermeiden. Mehrere starke Onkogene, einschließlich c-Myc und SV40 large T-Antigen, sind bekannt, die Produktion von induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSC) zu verbessern. Alle anderen bekannten iPSC-induzierenden genetischen Veränderungen (Oct4, Sox2, Klf4, NANOG, LIN28 und p53 Verlust der Funktion) auch Links zu Krebs, so dass sie relativ hoher Sicherheit betreffen, sowie.

Während diese im Zusammenhang mit Krebs Viren nützlich beim Studium der Reprogrammierung und Pluripotenz sind, müssen sie sicher verwendet werden. Um diese Fragen der biologischen Sicherheit, zeigen wir eine Methode zur Transduktion humaner Zellen mit ecotropen Lentivirus, mit zusätzlichem Schwerpunkt auf reduzierte Kosten und eine bequeme Handhabung. Wir haben ecotropen Lentivirus mit einer ausreichend hohen Titer produziert, um mehr als 90% der transduzieren-Rezeptor-exprimierenden menschlichen Zellen mit dem Virus, der Validierung der Wirksamkeit dieses Ansatzes.

Lentivirus ist oft durch Ultrazentrifugation konzentriert, allerdings dauert dieser Vorgang mehrere Stunden und kann Aerosole Infektionskrankheiten des Menschen biomedizinische Forscher produzieren. Als Alternative, virale Partikel können mehr sicher auf Zellen werden durch Komplexierung mit Chondroitinsulfat und Polybren (CS / PB) sedimentiert. Diese Technik erhöht die funktionelle virale Titer von bis zu 3-fach in den Zellen stabil exprimieren Mäuse-Retrovirus-Rezeptor, mit vernachlässigbaren zusätzlichen Zeit-und Kosten. Transduktion von humanen dermalen Fibroblasten (HDF) ist maximal erweitert mit CS / PB-Konzentrationen etwa 4-fach niedriger als der optimale Wert zuvor für Krebszelllinien gemeldet, was darauf hindeutet, dass Polymer-Konzentration für die Zielzelle Art der Verzinsung sollte titriert werden. Deshalb beschreiben die Verwendung von methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid (MTT) zum Testen auf Polymer-Toxizität in einem neuen Zelltyp. Wir beobachten, entspricht Lebensfähigkeit der HDF nach einer viralen Transduktion entweder mit Polymer-Komplexierung oder der Standard-Dosierung von Polybren (PB, 6 pg / ml), was darauf hinweist minimal akute Toxizität.

In diesem Protokoll, beschreiben wir die Verwendung von ecotropen Lentivirus für die Überexpression von Onkogenen in menschlichen Zellen, wodurch die biologische Sicherheit Risiken und die Erhöhung der Transduktion Rate. Wir zeigen auch die Verwendung von Polymer-Komplexierung Transduktion zu verbessern und gleichzeitig die Vermeidung aerosolbildende Zentrifugation von Viruspartikeln.

Protokoll

1. Produktion, Ernte und Einfrieren von Lentiviren

1. Wenden Sie sich an Ihren institutionellen Sicherheitsbeauftragten, bevor Sie mit diesem Protokoll beginnen, und befolgen Sie die empfohlenen Sicherheitsrichtlinien.
2. Tag 1. Beginnen Sie mit gesunden, schnell wachsenden 293T-Zellen, um Viren zu produzieren. Plattieren Sie die Zellen bei 5 x 10⁶ Zellen pro 10 cm Platte. Verwenden Sie für die Virusproduktion antibiotikafreies 293T-Medium (DMEM mit hohem Glukosegehalt und 10 % FBS und 4 mM L-Glutamin).
3. Tag 2. Am späten Nachmittag werden 293T-Zellen wie folgt transfiziert (die angegebenen Zahlen gelten für eine 10-cm-Platte). Lassen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmen. Pipettieren Sie 375 μl OptiMEM in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dann 25 μl hinzu Fugene HD. Lassen Sie unverdünnte Fugene nicht mit der Oberfläche des Rohres in Berührung kommen.
4. In einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen:
   • 5 μg Transferplasmid (Slc7a1, Zielvektor oder fluoreszierender Kontrollvektor)
   • 3,75 μg Verpackungsplasmid (pCMV-dR8,91 oder psPax2)
   • 1,25 μg Hüllplasmid (pMD2.G für pantropisch, pHCMV-EcoEnv für ökotrop)
   • serumfreies OptiMEM bis 100 μl
5. Kombinieren Sie die beiden Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung 20-30 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Wechseln Sie das Medium auf den 293T-Zellen auf 10 ml frisches, antibiotikafreies 293T-Medium. Fügen Sie die Fugene/Plasmid-Mischung hinzu Tropfen weise auf die Platte geben und über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren.
7. Tag 3. Wechseln Sie das Medium auf den 293T-Zellen auf 10 ml frisches, antibiotikafreies 293T-Medium. Sei sanftmütig, da 293T-Zellen nur locker haften und sich durch zu stark auf den Monolayer. Inkubieren Sie zwei Tage lang in einem befeuchteten Inkubator für die Virusproduktion.
8. Tag 5. Ernten Sie Viren und filtern Sie sie mit einem 0,45-mm-Filter mit geringer Proteinbindung. Sofort verwenden oder abgeben In Einmal-Aliquoten umwandeln und bei -80 °C einfrieren. Gefrorene pantropische und ökotrope Viren sollten nach der sechs Monate bzw. einen Monat gelagert wurden.
9. Titern Sie das Virus wie folgt, wobei Zellen verwendet werden, die relativ anfällig für die Transduktion sind. Zellen mit fluoreszierendem Kontrollvirus über Nacht in seriellen Verdünnungen (z. B. 1:10, 1:100, 1:1000) in frischem Medium mit 6 μg/ml PB transduzieren. Wechseln Sie am nächsten Tag zu frischem Medium. Lassen Sie die Zellen zwei Tage nach der Transduktion mit der Expression des fluoreszierenden Proteins beginnen und bestimmen Sie dann den Anteil der transduzierten Zellen durch FACS. Berechnen Sie den Titer in Transformationseinheiten (TU) pro ml, basierend auf Verdünnungen, die eine Transduktion von < 15 % ergeben, um mehrere Transduktionsereignisse zu minimieren.
   

2. Transduktion menschlicher Zielzellen mit dem murinen Retrovirus-Rezeptor Slc7a1

1. Wählen Sie eine Multiplizität der Infektion (MOI) = 2, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen transduziert werden. Für Zielzellen, die resistent gegen Transduktion sind, wie z. B. HDFs, ist ein höherer MOI erforderlich. Wir verdünnen den Virusüberstand nur 1:2, um eine Transduktion eines Großteils der Zellen zu erreichen.
2. Die Zielzellen werden über Nacht mit einem Virusüberstand transduziert, der in frischem Kulturmedium mit 6 μg/ml PB verdünnt ist, wodurch die Transduktion erhöht wird, indem die elektrostatische Interaktion zwischen dem Virus und der Zielzelle verbessert wird. ¹ Idealerweise sollte man ein minimales Virusvolumen verwenden, z. B. 1 ml für eine 35-mm-Platte, da die Diffusion ein limitierender Faktor für die Transduktionseffizienz ist.
3. Kultur der Zellen für mindestens 48 Stunden nach der Entfernung des Virus, bevor sie mit dem ökotropen Virus transduziert werden, um eine ausreichende Expression des Slc7a1-Rezeptors zu gewährleisten.
4. (Optional) Es ist möglich, Blasticidin zu verwenden, um stabil transduzierte Zellen auszuwählen, die Slc7a1 exprimieren, falls gewünscht. Im Vorfeld sollte eine Blasticidin-Kill-Kurve erstellt werden, um die niedrigste effektive Konzentration zu bestimmen, die in der Regel zwischen 2 und 10 μg/ml liegt und alle nicht transduzierten Zielzellen innerhalb von 7 Tagen abtötet. Etwa 2 Tage nach der Entfernung des Slc7a1-Virus stellen Sie die transduzierten Zellen auf ein Medium um, das Blasticidin enthält. Kultivieren Sie die Zellen 7 Tage lang in einem Blasticidin-haltigen Medium, wobei alle verbleibenden Zellen den Retrovirus-Rezeptor stabil exprimieren, woraufhin sie mit dem ökotropen Virus transduziert und für die zukünftige Verwendung als stabile Slc7a1-exprimierende Linie gespeichert werden können.

3. Titration von Polymerkomplexen zur Bestimmung der Toxizität

1. Tag 1. Plattenzellen mit 5000 Zellen/Well in einer 96-Well-Platte, wobei mindestens dreifache Wells für jede Versuchsgruppe möglich sind. Einschließen Sie nicht transduzierte Zellen in vollständigem Medium, um einen Ausgangswert für gesunde Zellen zu erhalten, sowie Proben, die aus Zellen in serumfreiem Medium bestehen, um einen Wachstumsstillstand als Kontrolle zu induzieren. Parallel dazu werden Plattenzellen in einem geeigneten Format (z. B. eine 24-Well-Platte) für die mikroskopische oder FACS-basierte Analyse der Transduktionseffizienz unter jeder experimentellen Bedingung verwendet.
2. Tag 2. Transduzieren Sie Zellen in Platten, die sowohl für die MTT- als auch für die FACS-Analyse mit Viruskodierung GFP eingerichtet sind, bei einem MOI von 0,5, um ~40% der Zielzellen zu transduzieren. Testen Sie unterschiedliche Konzentrationen von CS/PB (z. B. 50, 100, 200, 400, 600 und 800 mg/ml jeder Komponente) sowie 6 μg/ml PB, um optimale Mengen zu bestimmen. Erzeugen Sie Polymerkomplexe, wie in Teil 4 unten beschrieben.
3. Tag 3. Entfernen Sie virenhaltiges Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Stellen Sie die Platten wieder in einen befeuchteten Inkubator.
4. Tag 5. Analysieren Sie die FACS-Platte, um die Transduktionseffizienz mit jeder Polymerkonzentration zu bestimmen.
5. Tag 6. Entfernen Sie das Medium aus allen Vertiefungen der MTT-Platte und ersetzen Sie es durch 100 μl MTT-Lösung (1 mg/ml MTT in vollständigem Medium). Drei Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator kultivieren, um die MTT in den Mitochondrien stoffwechselaktiver Zellen reduzieren zu können.
6. Die MTT-Lösung wird entfernt und durch 200 ml MTT-Lösungsmittel (0,1 N HCl, 0,1 % Igepal CA-630 in Isopropanol) ersetzt.
7. Zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren oder bis sich der gesamte violette MTT-Formazan-Niederschlag aufgelöst hat. Lesen Sie die Absorption auf einem Mikroplatten-Reader bei 570 nm ab und subtrahieren Sie den Hintergrundwert bei 690 nm.
8. Wählen Sie die optimale Polymerkonzentration, die eine maximale Verbesserung der Transduktion bewirkt, wie durch FACS bestimmt, mit minimaler Auswirkung auf die Stoffwechselaktivität, wie durch MTT bestimmt. Für HDFs haben wir 100 μg/ml CS/PB ausgewählt, basierend auf den Daten, die in den repräsentativen Ergebnissen unten gezeigt werden.

4. Ökotrope Transduktion mit Polymerkomplexierung

1. Steril filtrierte Stammlösungen von PB und Chondroitinsulfat bei 20 mg/ml in Wasser herstellen. Aliquotieren und bei -20°C lagern.
2. Den Virusüberstand in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und mit frischem Kulturmedium auf die gewünschte Endkonzentration (z. B. MOI von 2) verdünnen. Geben Sie nacheinander gleiche Mengen PB und Chondroitinsulfat (Konzentrationen in Schritt 3 oben) hinzu und schnippen Sie nach jeder Zugabe mit dem Röhrchen, um es zu mischen. Das Virusgemisch wird sofort trüb, wenn sich Ausfällungen bilden. Inkubieren Sie das Virusgemisch 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine komplexe Bildung zu ermöglichen.
3. Entfernen Sie das Medium von den Rezeptor-exprimierenden Zielzellen, ersetzen Sie es durch den Virusmix und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2. Waschen Sie nach dem Entfernen des Virusmixes die Oberfläche der Zellen zweimal mit PBS, um die Entfernung viraler Komplexe zu erleichtern. Eine vollständige Entfernung ist nicht erforderlich; Wir haben keine nachteiligen Auswirkungen auf die Zellgesundheit durch verbleibende Polymerkomplexe beobachtet.

5. Überprüfung der Spezifität der ökotropen Transduktion

1. Bei der erstmaligen Herstellung eines ökotropen Virus ist es aus Sicherheitsgründen ratsam zu überprüfen, ob das Virus nicht in der Lage ist, unveränderte menschliche Zellen zu transduzieren. Humane Zellen mit ökotropen Lentiviren in relativ hoher Konzentration (nur eine 1- bis 2-fache Verdünnung des Virusüberstands in frischem Medium) über Nacht mit 6 μg/ml PB oder optimierter CS/PB-Konzentration transduzieren.
2. Entfernen Sie virenhaltiges Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Nach 2-tägiger Inkubation der Zellen ist die Transgenexpression durch FACS unter Verwendung von Fluoreszenzvektoren und/oder durch RT-PCR mit transgenspezifischen Primern zu validieren.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Abb. 1A zeigt den Produktionsprozess des Lentivirus, und Abb. 1B zeigt die Transduktion menschlicher Zellen mit ökotropem Lentivirus, einschließlich der Prätransduktion mit dem murinen Retrovirus-Rezeptor Slc7a1. Für die Titerung des Virus verwenden wir eine humane Rhabdomyosarkom-Zelllinie, die stabil mit Slc7a1 (Slc-hRMS) transduziert wurde. Bei der Verwendung von fluoreszierenden Kontrollvektoren zur Überwachung der Transduktionseffizienz erreichen wir routinemäßig > Transduktionseffizienz von 90 % von Slc-hRMS mit ökotropen Viren, wie in Abb. 2A und 2B gezeigt. Die Transduktionsraten von HDFs sind im Allgemeinen niedriger, da die Zellen nicht für die Rezeptorexpression von Blasticidin selektiert wurden (Abb. 2C). Die Titer des ökotropen Lentivirus betragen im Allgemeinen 10-20% der VSV-pseudotypisierten Viren, wenn sie mit Slc-hRMS gemessen werden (Abb. 2D).

Ein Frost-Auftau-Zyklus reduziert den Titer des ökotropen Virus um 16 - 3%, was dem Titerverlust während eines einzigen Frost-Auftau-Zyklus von VSV-pseudotypisierten Viren entspricht (p > 0,05). Im Gegensatz zu früheren ^Berichten2 beobachten wir keinen positiven Effekt auf den Virustiter durch Schockfrosten in Trockeneis. Vielmehr erreichen wir höhere Post-Tau-Titer beider Pseudotypen, indem wir einfach Röhrchen mit dem Virus in einen -80°C-Gefrierschrank legen (Daten nicht gezeigt).

Der MTT-Viabilitätsassay ermöglicht den sensitiven Nachweis von Wachstumsstillstand in Zielzellen. Die Transduktion mit Viren plus Konzentrationen von CS/PB bis zu 800 μg/ml hat keinen Einfluss auf den HDF-Metabolismus (Abb. 3A). Die Exposition gegenüber CS/PB ohne Viren hat auch keine toxische Wirkung auf Zellen (Daten nicht gezeigt). Die FACS-Analyse von HDFs, die mit Viren plus verschiedenen Konzentrationen von CS/PB transduziert wurden, zeigt eine Verbesserung der Transduktion im Vergleich zu PB allein (Abb. 3B). Die maximale Verbesserung tritt bei 100 μg/ml CS/PB auf (Abb. 3C), was um ein Vielfaches niedriger ist als die zuvor berichteten Werte. ³ Daher ist es wichtig, die Bedingungen für einen bestimmten Zielzelltyp zu optimieren.

Die Komplexierung mit CS/PB erhöht den beobachteten Titer in Slc-hRMS etwa um das 3-fache (Abb. 4A, S. < 0,01). In der Praxis ergibt sich daraus ein größerer Effekt auf die Transduktionseffizienz bei niedrigen Viruskonzentrationen als bei höheren Konzentrationen (Abb. 4B), was höchstwahrscheinlich auf mehrfach transduzierte Zellen und die Rezeptorsättigung bei höheren Viruskonzentrationen zurückzuführen ist.

Die Transduktion mit ökotropen Viren ist spezifisch für Zellen, die murine Retrovirus-Rezeptoren exprimieren. Bei der Transduktion von unmodifizierten humanen Zellen mit ökotropen Viren haben wir keine Fluoreszenz beobachtet, die größer als der nicht transduzierte Hintergrund ist, egal ob PB oder CS/PB verwendet wurde, wie in Abb. 5A gezeigt. Mikroskopisch zeigen HDFs in Abwesenheit des Rezeptors keine Transduktion (Abb. 5B), während die Prätransduktion mit dem Rezeptor zu fluoreszierenden Zellen führt (Abb. 5C).

Abbildung 1. Schematische Darstellung von (A) dem Prozess der Virusproduktion und (B) der Transduktion menschlicher Zellen mit dem murinen Retrovirus-Rezeptor, gefolgt von einem ökotropen Lentivirus.

Abbildung 2. Hocheffiziente Transduktion humaner Zellen mit ökotropen Lentiviren, die für GFP kodieren. Die Zellen wurden mit dem murinen Retrovirus-Rezeptor Slc7a1 vortransduziert. (A) Humane Rhabdomyosarkom-Zelllinie, Blasticidin-selektiert für Slc7a1 (Slc-hRMS), transduziert (blau) oder nicht transduziert (rosa) mit GFP. (B) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von ökotrop transduziertem Slc-hRMS (4X). (C) HDFs, transduziert (blau) und nicht transduziert (rosa) mit ökotropem GFP-Lentivirus; Die Zellen wurden zwei Tage vor der ökotropen Transduktion mit Slc7a1 transduziert. (D) Titer des VSV-G pseudotypisierten und ökotropen Lentivirus, gemessen mit Slc-hRMS.

Abbildung 3. Optimierung der Chondroitinsulfat/Polybrene (CS/PB)-Konzentrationen in humanen dermalen Fibroblasten. (A) Lebensfähigkeit von HDFs, gemessen mit MTT-Assay nach Transduktion nur in Gegenwart von PB oder mit unterschiedlichen CS/PB-Konzentrationen. (B) Erhöhung der Transduktionseffizienz in HDFs durch unterschiedliche CS/PB-Konzentrationen, gemessen mit FACS. (C) Quantifizierung der Transduktionsverstärkung, wobei gezeigt wird, dass die maximale Transduktion bei 100 μg/ml CS/PB auftritt.

Abbildung 4. Wirkung von 400 μg/ml CS/PB auf die Transduktion von Slc-hRMS mit ökotropen Lentiviren. (A) Titerverstärkung und (B) faltige Änderung der Transduktionsrate im Vergleich zu 6 μg/ml Polybrene allein.

Abbildung 5. Fehlende ökotrope Transduktion von HDFs in Abwesenheit des murinen Retrovirus-Rezeptors Slc7a1. (A) FACS-Plot von humanen BJ-Fibroblasten, nicht transduziert (rosa) oder transduziert (blau) mit ökotropem GFP-Lentivirus in beiden Fällen in Abwesenheit des Rezeptors Slc7a1. BJ humane Fibroblasten, transduziert mit ökotropem GFP-Lentivirus, ohne (B) und mit (C) Prätransduktion mit Rezeptor Slc7a1 (4X).

Diskussion

Rekombinante ecotropen gammaretrovirus auf Moloney Maus-Leukämie-Virus (MLV) und sein Rezeptor mSlc7a1 Basis sind gut untersucht und überall erhältlich, mit mehr als 20 Jahren verwendet worden, um Transgenen auf murine Zellen liefern. Ecotropen gammaretrovirus wurde auch in jüngerer Zeit, um Onkogene, menschliche Zellen zu liefern verwendet;. Im Rahmen der Reprogrammierung, die Verwendung von mSlc7a1 zu Generation amphotropen Virus beherbergen menschlichen Onkogene zu vermeiden, ist gut etabliert ^4,5 Allerdings sieht Lentivirus erhebliche Vorteile gegenüber gammaretrovirus in transduzierenden feuerfesten Zellpopulationen, ⁶ einschließlich Primärzellen, die oft wünschenswert, Ziele für die Neuprogrammierung, weil die lentiviralen Präintegrationskomplexes ermöglicht Transduktion von nicht-teilenden Zellen. ⁷

Lentiviren haben mit Dutzenden von verschiedenen Pseudotypen, einschließlich MLV, in dem Bemühen, Virus Tropismus, Toxizität und andere Eigenschaften. ⁸ MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus wurde verwendet, um Zellen der Maus, ⁹ transduzieren, hat aber nur selten auf menschliche Zellen verwendet worden verändern produziert . ¹⁰ Wir schlagen daher die Verwendung von MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus als eine sichere, kostengünstige und hocheffiziente Fahrzeug bekannter oder vermuteter Onkogene, einschließlich der Reprogrammierung Faktoren, die menschliche Zellen zu liefern.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll nicht vollständig beseitigen die Notwendigkeit zu produzieren und zu nutzen pantropic Lentivirus, sondern trennt dieses Protokoll das Onkogen (s) aus dem pantropic Virus, isolierende Forscher vor möglichen Selbst-Impfung mit dem Krebs-verwandten Viren. Das Protein mSlc7a1 und seine menschliche Homolog hSlc7a1 sind ubiquitär Aminosäure-Transporter ohne bekannte Tumorigenität oder Fähigkeit, ein selektives Wachstum Vorteil Empfänger-Zellen übertragen, ¹¹ machen mSlc7a1 von relativ geringem Risiko für den Einbau in amphotrope Virus exprimiert. Dieser zusätzliche Schritt kann besonders nützlich in Labors fehlen gewidmet Virus oder Gewebekultur Einrichtungen der erforderlichen Sicherheitsstufe.

In manchen Situationen kann es möglich sein, vollständig zu eliminieren die Verwendung von pantropic Virus durch Transfektion der Slc7a1 Plasmid direkt in Zielzellen, jedoch sind viele Zellen, die nützliche Ziele dieser Technik werden auch feuerfeste der Transfektion. Als Alternative, die Fähigkeit zu isolieren Slc7a1-transduzierten Zellen durch Blasticidin Auswahl bedeutet, dass VSV-G pseudotypisiert Lentivirus einmal verwendet werden kann, um einen Bestand von Rezeptor-exprimierenden Zellen, nach denen ecotropen Virus routinemäßig eingesetzt werden können, um diese Zellen für viele transduzieren generieren Experimente. Forscher sollten immer nach ihrer institutionellen Sicherheit Richtlinien für die Arbeit mit einem Lentivirus, unabhängig von ihrer Tropismus.

Titer ecotropen Virus mit diesem Protokoll erreicht werden moderat niedriger als VSV-pseudotypisiert Virus, in der Regel 10-20% des pantropic Virustiter, in Übereinstimmung mit früheren Studien. ⁹ Diese Titer in menschlichen Zellen wurden gemessen stabil transduzierten mit Slc7a1, so dass die unteren beobachtet Titer für ecotropen Virus kann teilweise durch vielseitige Ausdruck der Rezeptor-Gen in die Zielzellen. Dennoch sind die viralen Titer in unserem Protokoll erreicht mehr als ausreichend für die meisten Anwendungen und führen zu Transduktion der Mehrzahl der Zellen, in einigen Fällen> 90% der Zellen.

Centrifugation-basierte Techniken werden häufig verwendet, um virale Partikel zu konzentrieren. Allerdings erfordert Zentrifugation mehrere Stunden, erzeugt infektiöse Aerosole, und kann zu einem erheblichen Verlust der viralen Partikel führen. ¹² Als Alternative Komplexierung mit CS / PB kann zur Transduktion ohne dass virale Tropismus zu verbessern. ³ Diese Methode ist schnell (5 Minuten ) und preisgünstig ($ 0,03 pro 10 ml-Virus), während etwa einer Verdreifachung der beobachteten Titer. Keine besondere Ausrüstung oder proprietären Reagenzien erforderlich sind, und wir beobachteten minimal akuten Toxizität nach der Exposition des HDF zu CS / PB, in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten in anderen Zelllinien. ¹³ Ein potenzieller Nachteil dieses Protokolls ist, dass einige mikroskopisch sichtbare Polymer-Komplexe zu halten die Zellen für mehrere Tage in Kultur. Wir können nicht ausschließen, dass diese Komplexe, die zwar nicht offen toxisch auf die Zellen, können subtilere Effekte auf zellulärer Prozesse haben.

Hier haben wir eine Methodik zur sicheren und effizienten Transduktion humaner Zellen mit onkogenen Faktoren beschrieben. Dieser Ansatz sollte von großem Nutzen für Forscher studieren Onkogene und Stammzellbiologie einschließlich iPS-Zellen sein.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murine MLV-Rezeptor
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G Umschlag
pCMV-dR8.91	D. Trono Labor 14		Packaging-Plasmid (entspricht Plasmid psPax2 ist ab Addgene, Cat. Anzahl 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropen Umschlag
FUGW	Addgene	14883	GFP Kontroll-Plasmid
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrinbromid (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268
Chondroitinsulfat Natriumsalz aus Haifischknorpel	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidin S	Fischer	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021