Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse

51.1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/2879

⸱

8. Mai 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, University of Florida, 2Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die intraluminale Mitte Zerebralarterie (MCAO) Modell ist die häufigste verwendete Modell unter experimentellen Schlaganfall-Modellen. Hier zeigen wir Ihnen das gesamte Modell im Detail mit der Führung des Laser-Doppler-Flussmessung und seine repräsentative Ergebnisse.

Zusammenfassung

Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und die führende Ursache von Behinderungen in der Welt, mit geschätzten Kosten von in der Nähe 70000000000 $ in den Vereinigten Staaten im Jahr 2009 1,2. Die intraluminale Mitte Zerebralarterie (MCAO)-Modell wurde von Koizumi 4 in 1986 entwickelt, um diese wirkungsvoller menschlichen Pathologie in der Ratte zu simulieren. Eine Änderung der MCAO Methode wurde später von Longa 3 dargestellt. Beide Techniken wurden häufig verwendet, um molekulare Mechanismen der Hirnschädigung durch Schlaganfall und mögliche therapeutische Modalitäten 5. identifizieren. Diese relativ nichtinvasive Methode an Ratten wurde erweitert, um in Mäusen verwendet, um die Vorteile von transgenen und Knockout-Stämme 6,7 zu nehmen. Zur Modellierung fokaler zerebraler Ischämie ist eine intraluminale Faden über die A. carotis interna an der Basis der MCA verschließen fortgeschritten. Zurückziehen der Naht nach einer bestimmten Zeit imitiert spontanen Reperfusion, aber die Naht kann auch dauerhaft beibehalten werden. Dieses Video demonstriert die beiden wichtigsten Ansätze zur Durchführung von intraluminalen MCAO Verfahren bei Mäusen in einem schrittweisen Mode, sowie Einblicke für potenzielle Nachteile und Gefahren. Der ischämische Hirngewebe wird anschließend von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) angefärbt werden, um das Ausmaß der Hirninfarkt 8 zu bewerten.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) an der University of Florida und ist in Übereinstimmung mit den "Principle of Laboratory Animal Care" (NIH Publikation Nr. 86-23, revised 1985).

1. Materialien

  1. Tiere: Männliche C57BL / 6 Mäuse (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) mit einem Gewicht von 20-26 Gramm zum Zeitpunkt der Operation.
  2. Anästhesie:
    1. Anästhesiegerät: VetEquip Inhalationsnarkose System (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA).
    2. Inhalationsnarkose: Isofluran (Baxter Pharmazie, Deerfield, IL).
  3. Chirurgische Instrumente: SuperCut Iris Schere, gerade (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); Vannas Mikro-Schere, gerade (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); Dumont Pinzetten (feine Spitze, 45 ° gebogene Spitzen, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); bipolare Koagulation Einheit (High Frequency Exsikkator 900, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); Mikro-Gefäß-Clip (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
  4. Chirurgische Versorgung: Sterile Baumwolle Tipps, Wipes, Gaze Schwämme; Suture (7-0 Seidenfaden, Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA); Gewebekleber (Vetbond, 3M Company, St. Paul, MN, USA); Surgical Scrub : Bethadine, 70% Ethanol und 0,9% Kochsalzlösung, Augensalbe (Puralube Vet-Salbe, PharmaDerm, Melville, NY, USA).
  5. Occlusion Naht Vorbereitung MCAO:
    1. Filament für MCA-Okklusion: 7-0 chirurgischen Nylon Monofilament Nahtmaterial (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA).
    2. Wärmequelle für Abstumpfung Naht Spitze (Thermokauter Unit, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL).
    3. Flüssigem Silikonkautschuk (RTV Kleber, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA).
  6. Chirurgisch / Binokular (Leica Stereomikroskop MZ6).
    1. LWL-Hilfslicht (Fiber Optic-Hilfslicht FO1-150, TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA).
  7. Laser-Doppler-Flussmessung (Periflux System 5000, Perimed, Stockholm, Schweden).
    1. Flexible Mikrospitze (MT B500-0 Gerade Mikrospitze, Perimed, Stockholm, Schweden)
  8. Temperatur-Parameter:
    1. Rektale Temperaturen zu überwachen (BAT-12, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL).
    2. Wärmedecke (T / PUMP, TP600, Gaymar, NY, USA).
  9. Beizen und quantitative Messung des Volumens Infarkt:
    1. 2% ige Lösung 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (2% TTC, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA).
    2. Mäuse Gehirn Matrix Allesschneider (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA).
    3. Digitalkamera (V1253, Kodak Co., Rochester, NY, USA).
    4. Image J Software (ImageJ 1.42q Software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA).

2. Präoperative Schritte

  1. Vor der Operation werden die Mäuse unter einem 12:12 Hell / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Nagetieren chow untergebracht.
  2. Nahtmaterial für MCAO durch Abstumpfung 1-2mm der Naht Spitze mit Wärme und Beschichtung 3-4mm der Naht Welle von ihrer Spitze mit flüssigem Silikonkautschuk hergestellt, so dass sie trocken (7-0; Spitzendurchmesser, 0.20-0.25; Beschichtung Länge, 3-4mm; Fadenlänge 11-13mm). Sterilität sollte bei allen der oben genannten Schritte beibehalten werden.
  3. Nach Abwägung der Maus, wird die Narkose mit 4% Isofluran in einer Induktion Kammer induziert und aufrecht erhalten während des Verfahrens mit 1.5-2% Isofluran in 30% O 2 und 70% N 2 O Gas-Gemisch über eine Gesichtsmaske.
  4. Die Maus ist in Bauchlage auf einem Gaze liegend auf einem temperierten Bedienoberfläche (Wärmedecke) gelegt, der Kopf Fell rasiert.
  5. Schmiermittel Augensalbe ist, beide Augen aufgetragen, und die Augenlider geschlossen sind, um Auge Austrocknung während des chirurgischen Verfahrens zu verhindern.
  6. Ein Medianschnitt (1 cm) wird auf die Haut über dem Schädeldach von Linea nuchae superior zum Nasion und die Haut wird seitlich zur Anbringung eines flexiblen Mikrospitze (; 0,5 mm Durchmesser MT B500-0 Gerade Mikrospitze) gezogen hat. Die Mikrospitze steht senkrecht auf der Oberfläche des rechten Parietal-Schädel (1 mm posterior und 5 mm lateral des Bregma) platziert, um den Blutfluss in den MCA Gebiet von Laser-Doppler-Flussmessung zu überwachen.
  7. Stellen Sie sicher, dass die flexible Mikrospitze am Schädel fest, bevor das Tier zu einer Rückenlage gedreht angebracht ist. Den Hals des Tieres auf eine weiche Unterlage gelegt und seine Nase ist in Nasenkonus der Anästhesie statt. Dies wird in mit genügend Platz für die flexible Mikrospitze führen.
  8. Eine rektale Temperatur Sonde eingeführt, um eine konstante Tier Kerntemperatur von 37 ± 0,5 ° C zu halten
  9. Beide Vorderpfoten und Hinterpfoten sind den operativen Plattform Oberfläche geklebt, und der Schwanz ist das Darmrohr abgeklebt.

    10. 3. MCA-Okklusion Chirurgie:

    1. Unter dem Operationsmikroskop wird ein Mittellinie Hals Schnitt mit der Schere zwischen dem Manubrium und der Kiefer durch leichtes Anheben der losen Haut.
    2. Die gepaarten zugrunde liegenden submandibularis sind unverblümt aufgeteilt, wobei die linke Drüse in situ belassen. Das Recht submandibularis ist kranial und eingefahren zusammen mit dem M. sternocleidomastoideus gesichert.
    3. Die exponierte Teilung des M. omohyoideus für den Karotisscheide ist sorgfältig mit Pickups unterteilt.
    4. Die rechte Arteria carotis communis (CCA) wird sorgfältig getrennt und aus dem Vagus und der Scheide (befindet sich seitlich CCA) isoliert.
    5. Jenseits auseinander die 2 chirurgische Methoden, die verwendet wurden häufig zu MCA-Okklusion durchzuführen:

    Koizumis 4 Methode

    1. Drei lose Kragen Nähten (7-0 Seide) sind rund um die richtige CCA vorbereitet.
    2. Die A. carotis externa (ECA) ist identifiziert, isoliert und verödet (2-3mm distal Bifurkation). Es kann anschließend mit Mikro-Schere geteilt werden. Zur Vermeidung von unbeabsichtigten periphere Schäden an der Kauterisation site, sollte die Macht bei 1 mit der Kraft Drehknopf eingestellt werden. Dies ist konsistent für alle Verätzungen.
    3. Ausreichende Spannung ist es, die proximalen Kragen Naht auf der CCA, um den Blutfluss (permanente Ligation) verschließen angewendet. Der Fluss Okklusion wird durch eine ca. 50% Rückgang von Baseline kortikalen Perfusion Werte verifiziert.
    4. Dann ein Schiff Clip wird kurz vor dem CCA Bifurkation platziert, um retrograden Fluss zum Zeitpunkt der Arteriotomie zu vermeiden.
    5. Ein Arteriotomie ist zwischen dem proximalen ligiert Naht und das Schiff Clip auf der CCA mit Mikro-Schere (näher an Ligation) durchgeführt.
    6. Die Wärme-abgestumpft silikonbeschichteten 7-0 Nylonfaden über die Arteriotomie eingeführt und bis es das Schiff Clip erreicht. Die 2 restlichen losen Kragen Nähte werden sanft um die CCA zwischen den Arteriotomie und das Schiff Clip zu vermeiden Rückfluss Leckage durch CCA, mit Vorsicht nicht an die Arterienwand traumatisieren angezogen, dann das Schiff Clip wird zurückgezogen.

    Longa der 3-Methode

    1. Die ECA wird identifiziert, seziert so viel wie möglich (in der Nähe der Bifurkation in mehrsprachigen und Oberkiefer Arterien), geätzt (mit Strom gesetzt zu 1) und teilte mit Mikro-Schere.
    2. Zwei lose Kragen Nähten (7-0 Seide) sind rund um die proximalen ICA knapp oberhalb der Bifurkation CCA vorbereitet.
    3. Der CCA ist vorübergehend mit einem Gefäß-Clip verschlossen. Der Fluss Okklusion wird durch eine ca. 50% Rückgang von Baseline kortikalen Perfusion Werte verifiziert.
    4. Dann wird der ICA ist vorübergehend mit einem Gefäß-Clip über die beiden losen Kragen Nähte retrograden Fluss zum Zeitpunkt der Arteriotomie vermeiden geschlossen.
    5. Ein Arteriotomie erfolgt über Mikro-Schere in der reflektierten ECA in der Nähe der Stumpf.
    6. Die Wärme-abgestumpft silikonbeschichteten 7-0 Nylonfaden über die Arteriotomie in ECA eingeführt und bis es die aufgebrachte Schiff Clip in ICA erreicht. Die 2 lose Kragen Nähte in proximalen ICA werden sanft um den proximalen ICA angezogen bis zum Rückfluss der Blutfluss durch ICA zu vermeiden, mit genügend Aufmerksamkeit nicht auf die Arterienwand traumatisieren, dann das Schiff Clip wird zurückgezogen.

    Der Rest des Verfahrens ist weitgehend konvergent:

    1. Das Verschließen Naht wird langsam durch A. carotis interna (ICA) in Richtung der Schädelbasis vorgeschoben, bis eine leichte Widerstand zu spüren ist. Eine gleichzeitige Rückgang des zerebralen Blutflusses als Prozentsatz (= 80%) gegenüber dem Ausgangswert wird mittels Laser-Doppler-Flussmessung bestätigt. Die 2 Kragen Nähte sind rund um die eingesetzten Filament verschärft.
    2. Für transiente zerebrale Ischämie Experimenten wird die Okklusion Naht sanft nach 45 Minuten zurückgezogen. Dieser Zeitpunkt kann für verschiedene experimentelle soll geändert werden.
    3. Nach dem Abziehen des Fadens Faden, ist die Arteriotomie Website geschlossen, um postoperative Blutungen zu vermeiden. In Koizumis Methode handelt es sich dabei sicher Anziehen der Kragen Nähte rund um die CCA. In Longa-Technik, die Arteriotomie Ort an der Basis der ECA ist verödet, dann der Kragen Nähte am proximalen ICA werden gelockert und entfernt werden, um die Halsschlagader fließen wiederherzustellen.
    4. So schließen Sie den Schnitt sind die submandibularis und SCM in den operativen Bereich gelegt. Die Wundränder werden dann mit Gewebekleber in Hals-und Kopfhaut Bereichen angenähert. Alternativ könnte ein resorbierbares Nahtmaterial oder Metall Grundnahrungsmittel verwendet werden, um die Wunde vor allem, wenn das langfristige Überleben des Tieres soll enger werden.
    5. Nach Inzision Schließung, erhält das Tier 1 ml warme Kochsalzlösung subkutan als Volumen Nachschub. Eine Dosis von geeigneten Schmerzmitteln (zB Buprenorphin bei 0.05-0.1 mg / kg) sollte verwendet werden, um Tier Schmerzen und Beschwerden beim Erholungsphase zu minimieren. Die Animal wird aus der OP entfernt und in einem warmen Aufwachraum / Käfig, um eine Unterkühlung zu vermeiden, mit freien, einfachen Zugriff auf weiche Nahrung und Wasser.

    4. Post-Op neurologischen Untersuchung

    Nachdem das Tier gewinnt insgesamt Bewusstsein, können neurologische Defizite durch eine einfache Skala (Fünf-Punkte-Skala) ausgewertet werden wie folgt 3:

    1. keine beobachtbaren Defizite
    2. Nichtbeachtung kontralateralen Vorderpfote (mild fokale neurologische Defizit) zu verlängern
    3. kreisen in eine Richtung kontralateral zur Infarkt (moderate fokale neurologische Defizit)
    4. fallen in eine Richtung kontralateral zur Infarkt (schwere fokale neurologische Defizit)
    5. herabgesetztes Bewusstsein, ohne spontane Bewegung

    5. Beizen und quantitative Messung der Gehirn Infarktvolumen

    1. Nach 24 Stunden MCA Reperfusion, hat der überlebende Maus gewogen, tief narkotisiert mit 4% isoflorane, und opferte nach genehmigten Protokoll.
    2. Das Gehirn ist vorsichtig entfernt und in eine Maus Gehirn Matrix Hobel, und das gesamte Großhirn ist koronal geschnitten in 2 mm Abständen.
    3. Die Abschnitte sind in 2% TTC in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C für 20 Minuten eingetaucht. Nach TTC-Färbung, ist infracted Bereich als weiß (ungefärbt) angrenzenden Gewebe bis hin zu ziegelrot (lebensfähigen) Gewebe (Abbildung 1) gezeigt.
    4. Serielle Schnitte fotografiert mit einer Digitalkamera und der Bereich der Infarkt ist mit dem Bild J-Programms gemessen.
    5. Der Bereich der Infarkt (weiß, ungefärbten), den Bereich der ipsilateralen Hemisphäre (weiß und roten Ziegeln, gebeizt) und im Bereich der kontralateralen Hemisphäre (aus rotem Backstein, gebeizt) werden für jeden Abschnitt gemessen. Das Volumen wird durch die Summe der repräsentativen Bereichen in allen Teilen und Multiplizieren mit der Schichtdicke berechnet. Nach Korrektur für Ödeme, ist das Volumen des Infarktes wie folgt 9 berechnet:
      Korrigierte Infarktvolumen (CIV),% = [kontralateralen Hemisphäre Volumen - (ipsilateral Hemisphäre Volumen - Infarktvolumen)] / kontralateralen Hemisphäre Volumen x 100

    6. Repräsentative Ergebnisse

    Nach Okklusion und Reperfusion der MCA über links CCA um transiente zerebrale Ischämie zu etablieren, werden die Tiere getötet und ihre Gehirne sind koronal geschnitten mit TTC gefärbt, um das Volumen des Infarkts (Abbildung 1) zu bewerten.

    figure-protocol-1
    Abbildung 1. TTC-gefärbten serielle koronalen Hirnschnitten (2 mm) von Mäusen zu MCA-Okklusion unterzogen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die MCAO Modell ist ein etabliertes Modell, das zerebrale Ischämie repliziert in murinen Arten. Dieses Modell wurde erstmals in Ratten verwendet und danach Mäusen angepasst. Vermeiden Kraniektomie, um den Einfluss der chirurgischen Manipulation am Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität und Hirndruck zu beseitigen ist ein Vorteil dieser Technik. Allerdings können viele Variablen, wie Stamm-Unterschiede 10, Größe der Naht Spitze 11, die Dauer der Okklusion 6, Körpertemperatur 12, Anä...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Typ Firma Katalog-Nummer Kommentare (optional)
Männlich C57BL / 6 Mäusen Tier Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA 20-26 grs
Dissektionsmikroskop Mikroskop Leica Stereomikroskop MZ6 Zoom 6.3:1
LWL-Hilfslicht Illuminator TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA FO1-150
Isofluran Anästhesie Baxter Pharmazie, Deerfield, IL 1001936060
SuperCut Iris Schere, gerade Chirurgisches Werkzeug World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 14218
Vannas Mikro-Schere, gerade Chirurgisches Werkzeug World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 14003
Dumont feine Spitze Pinzette Chirurgisches Werkzeug World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 503290
Schiff-Clip Chirurgisches Werkzeug World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 14120
High Frequency Exsikkator 900 Chirurgisches Werkzeug World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 500397
7-0 chirurgischen Nylon Monofilament Naht Naht Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA 1647G Suture für Okklusion
7-0 chirurgische Nahtmaterial Silk Naht Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA 7733G Suture für die Ligation
RTV Kleber Silikon-Kautschuk World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 1571
Vetbond Gewebekleber 3M Company, St. Paul, MN, USA 70200746587
Puralube Vet-Salbe Augensalbe PharmaDerm, Melville, NY, USA
Buprenorphin hydrochlorode Analgetika Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA NDC 0409-2012-32
Thermokauter Einheit World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 501292
Periflux System 5000 TCD Flowmetrie Perimed, Stockholm, Sweeden
BAT-12 Rektalthermometer World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA BAT-12R
T / PUMP, TP600 Wärmedecke Gaymar, NY, USA
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid Reagens Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA T8877
Mäuse Gehirn Matrix Allesschneider Brain-Allesschneider Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA BSMAS001-1

Referenzen

  1. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
  3. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
  4. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  5. Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
  6. Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
  7. Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
  8. Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
  9. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
  10. Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
  11. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
  12. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Nahtverschlusszerebraler InfarktTTC F rbungneurologische DefiziteMausmodellReperfusionsbeurteilung
Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.