Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Zusammenfassung

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Zusammenfassung

Trotz der Fortschritte in der Modellierung menschlichen Medikamententoxizität scheitern viele Verbindungen in klinischen Studien wegen unvorhergesehener Nebenwirkungen. Die Kosten für klinische Studien sind erheblich, deshalb ist es wichtig, dass mehr prädiktiven Toxikologie Bildschirme entwickelt und frühzeitig in der Medikamentenentwicklung (Greenhough et al 2010) eingesetzt. Humane Hepatozyten stellen den aktuellen Gold-Standard-Modell für die Bewertung Medikamententoxizität, sondern sind eine begrenzte Ressource, die variable Funktion aufweisen. Daher sind die Verwendung von immortalisierten Zelllinien und tierischem Gewebe Modellen routinemäßig eingesetzt wegen ihrer Fülle. Während beide Quellen informative sind, werden sie durch eine schlechte Funktion, Arten Variabilität und / oder Instabilität in Kultur (Dalgetty et al 2009) begrenzt. Pluripotenten Stammzellen (PSCs) sind eine attraktive Alternative Quelle für humane Hepatozyten ähnlichen Zellen (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs sind in der Lage sich selbst erneuern und sich für alle somatischen Zelltypen des erwachsenen gefunden und stellen dabeieine potenziell unerschöpfliche Quelle von differenzierten Zellen. Wir haben ein Verfahren, das einfache, sehr effiziente, Automatisierung zugänglich und liefert funktionelle menschliche HLCs (; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 und Hay et al 2011 Hay et al 2008) entwickelt. Wir glauben, dass unsere Technologie, um das skalierbare Produktion von HLCs für die Wirkstoffforschung, Krankheit Modellierung, den Bau der extrakorporalen Geräten und möglicherweise zellbasierten Transplantation Therapien führen.

Protokoll

1. Erste Vorbereitung aller chemischen Aktien und Beschichtung von Kultur Plastikwaren

Alle Schritte, die in einem Gewebekultur Motorhaube durchgeführt werden unter aseptischen Bedingungen.

1. Vorbereitung des menschlichen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (hbFGF)
   1. Bereiten Sie 10% BSA-Lösung in PBS und durch ein 0,22 um-Filter.
   2. Von den 10% BSA-Lösung vorzubereiten einer 0,2% igen BSA-Lösung.
   3. Fügen Sie 10 ml 0,2% BSA solution/100 pg hbFGF.
   4. Vornässen ein 0,22 um-Filter durch Filterung 5 mL 10% BSA-Lösung durch den Filter. Entsorgen Sie die 10 mL BSA waschen.
   5. Filtern Sie die hbFGF du....

Diskussion

Wir haben eine einfache, homogene und reproduzierbare in vitro-Modell, um skalierbare Ebenen der menschlichen HLCs generieren entwickelt. Unser Modell wurde von einer Reihe von externen kooperierenden Laboratorien validiert. Wir routinemäßig charakterisieren Stammzellen abgeleitete HLCs mit unserem Haus in Tool-Box von Entwicklungs-Marker und der Leber spezifischen funktionellen Assays (die meisten davon sind im Handel erhältlich). Die kritischen Phasen in unserem Prozess sind: die Erhaltung von Stammzellen Plu.......

Materialien

Matrigel Beschichtung Platten und Flaschen

1. Matrigel (10 ml, BD Biosciences, UK); bei -20 ° C.
2. KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C.
3. Zellkulturplatten (6 gut, 12 gut, Corning, UK)
4. Zellkulturflasche (25 cm2 entlüftet, Corning, UK)

hESC Wartung

1. Maus embryonale Fibroblasten-konditioniertem Medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); bei -20 ° C.
2. BSA-Lösung (50 ml, Sigma Aldrich, UK); lagern bei 4 ° C.
3. Menschliche basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (100 ug, PeproTech, USA); bei -20 ° C.

Die Passage hESCs mit Kollagenase

1. Confluent gut oder Flasche hESCs.
2. Matrigel beschichteten Vertiefungen oder Flaschen als angemessen.
3. Phospate Kochsalzlösung (-MgCl _{2, CaCl-2)} (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei Raumtemperatur lagern.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C.
5. Maus embryonale Fibroblasten-konditioniertem Medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Menschliche basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (100 ug, PeproTech, USA).

Differenzierung von hES hepatische Entoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C.
2. B27 Supplement (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C.
3. Activin A (2 pg, PeproTech, USA); bei -20 ° C.
4. Rekombinantes Maus Wnt3a (2 g, R & D Systems, USA); bei -20 ° C.
5. KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C.
6. KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C.
7. Nicht-essentielle Aminosäuren (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C.
8. β-Mercaptoethanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); bei Raumtemperatur lagern
10. Leibovitz L-15 Kulturmedium (500 ml, Sigmein Aldrich, UK); lagern bei 4 ° C.
11. Tryptosephosphat Brühe (100 ml, Sigma Aldrich, UK); lagern bei 4 ° C.
12. Fetale Rinderserum, Hitze inaktiviert (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C.
13. Hydrocortison 21-hemisuccinat (100 mg, Sigma Aldrich, UK); bei -20 ° C.
14. Insulin (Rinderpankreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); bei -20 ° C.
15. L-Glutamin (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C.
16. Ascorbinsäure (25 g, Sigma Aldrich, UK); bei -20 ° C.
17. Menschliche HGF (10 ug, PeproTech, USA); bei -20 ° C.
18. Rekombinantem humanem Oncostatin M (OSM) (50 pg, R & D Systems, USA); bei -20 ° C.
19. Spritze getrieben Filtereinheit 0,22 um (Millipore, UK)

Charakterisierung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Leber Endoderm

Immunfärbung

1. Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung (-MgCl _{2, CaCl-2)} (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); store bei Raumtemperatur.
2. PBST, PBS aufgefüllt mit 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) wird in PBS hergestellt, speichern -20 ° C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), bei Raumtemperatur lagern.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), bei Raumtemperatur lagern.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), bei -20 ° C.
8. Sekundäre Antikörper, Alexa-Fluorophore (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) ist in Tris HCL und Glycerin als je Anweisungen des Herstellers hergestellt. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) ist die MOWIOL Lösung in einer 1:1000 verdünnt.

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Primärantikörper
Antigen *	Typ	Lieferant	Verdünnung
ALB	Monoklonalen Maus-	Sigma Aldrich	1 / 500
E-Cadherin	Monoklonalen Maus-	Millipore	1 / 100
α-Fetoprotein	Monoklonalen Maus-	Sigma	1 / 500
SSEA-4 FITC	Monoklonalen Maus-	Biolegend	1 / 100
IgG	Monoklonalen Maus-	DAKO	1 / 500
Sekundärantikörper
Anti-Maus-FITC-Konjugat	Goat Monoklonale	Invitrogen	1 / 400

Tabelle 2. Die Antikörper für hESC abgeleitet Leber Entoderm Immunfärbung verwendet, verwendet die Konzentrationen der Spezies in der Firmen entwickelt sie aus gekauft.

Funktionelle Analyse von Leber-und Endoderm Normalisation (pro mg Protein)

Cytochrom-P450-Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits und Luminometer (Promega, USA).
1. Weiß Flachboden 96 well Assay-Platte (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparente 96-Well-Assay-Platte (IWAKI, UK)