CRISPR-vermittelte Basen-Editing-Tools: Eine Genom-Editing-Technik zur Induktion einer gezielten Basensubstitution

Zusammenfassung

Quelle: Siehe, J. E., et al. Funktionelle Bewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-vermittelten Baseneditoren. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video erklärt das Konzept von CRISPR-vermittelten Cytosin-Baseneditoren zur Induktion einer gezielten Nukleotidsubstitution.

Protokoll

1. Erstellung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-vermittelten Basenbearbeitungswerkzeugen

HINWEIS: Wenn keine HAP1-BE3-Zelllinien verwendet werden, kann BE3-kodierende Plasmid-DNA mit BRCA1-targeting-gRNA co-transfiziert werden. Im Vergleich zur Co-Transfektion von BE3- und gRNA-Plasmiden induziert die Transfektion von gRNA-Plasmiden zu HAP-BE3-Zellen eine effiziente Baseneditierung bis zu 3-fach am Ziellocus in unseren Händen.

1. 5 x 10⁵ HAP1-BE3-Zellen (oder HAP1-Zellen bei Co-Transfektionsmethoden) pro Well in 24-Well-Platten 1 Tag vor der Transfektion aussäen. Zum Zeitpunkt der Transfektion werden die Zellen so kultiviert, dass sie eine angemessene Dichte (70 % – 80 % Konfluenz) erreichen.
2. Transfektieren Sie BRCA1-targeting-gRNAs unter Verwendung der gekauften Transfektionsreagenzien (Table of Materials) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwendung von 1 μg BRCA1-targeting-gRNAs (mit 1 μg BE3-kodierender Plasmid-DNA im Falle von Co-Transfektionsmethoden), um die Umwandlung von C:G in T:A an BRCA1-Zielstellen zu induzieren. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und subkulturieren Sie alle 3–4 Tage.
3. Ernten Sie die Zellpellets 3, 10 und 24 Tage nach der Transfektion, um die Effizienz der Basenbearbeitung zu analysieren (Proben von 3 Tagen nach der Transfektion werden als Proben von Tag 0 neu eingestuft).
4. Extrahieren Sie genomische DNA mit dem genomischen DNA-Aufreinigungskit (Table of Materials).
   HINWEIS: Wir empfehlen, die Transfektionsbedingungen mit einem variablen Verhältnis von Reagenz zu DNA zu optimieren. Die optimale Bedingung für die HAP1-Transfektion ist ein Verhältnis von Reagenz zu DNA in unseren Händen von 4:1.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lipofectamin 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027	Transfektionsreagenz
Opti-MEM	Gibco	31985070	Transfektionsmaterialien
FuGENE HD Transfektionsreagenz	Promega	Nr. E2311	Transfektionsreagenz
Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium	Gibco	12440046	Medium für HAP1-Zellen
lentiCas9-Blast	Addgene	Artikel-Nr.: 52962	Plasmid-DNA für die Klonierung von lentiBE3
DNeasy Blut- und Gewebe-Kit	Qiagen	Artikel-Nr.: 69504	Kit zur Vorbereitung genomischer DNA