Hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie: Eine Technik zur Trennung hydrophiler polarer Analyten mit Hilfe von hydrophilen Kügelchen

Zusammenfassung

Quelle: Liu, D., et al. Immunglobulin G N-Glykan-Analyse durch Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video demonstriert das Prinzip der Trennung von hydrophilen polaren Verbindungen mittels hydrophiler Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie. Diese Technik hilft bei der Aufreinigung verschiedener polarer Analyten, einschließlich N-Glykanen.

Protokoll

1. Hydrophile Interaktionschromatographie und Analyse von Glykanen

1. Konditionierung von UPLC-Instrumenten und Vorbereitung mobiler Phasen
   1. Bereiten Sie mobile Phasen vor, einschließlich Lösungsmittel A: 100 mM Ammoniumformiat (pH = 4,4), Lösungsmittel B: 100 % Acetonitril, Lösungsmittel C: 90 % Reinstwasser (10 % Methanol) und Lösungsmittel D: 50 % Methanol (Reinstwasser).
   2. Öffnen Sie die Software, um die mobilen Phasen zu steuern.
   3. Reinigen Sie UPLC-Instrumente 30 Minuten lang bei einer Flussrate von 0,2 ml/min (50 % Lösungsmittel B und 50 % Lösungsmittel C), dann 20 Minuten lang bei einer Flussrate von 0,2 ml/min (25 % Lösungsmittel A und 75 % Lösungsmittel B) und dann eine Flussrate von 0,4 ml/min ausgleichen.
2. Die mit 2-Aminobenzamid (2-AB) vormarkierten N-Glykane werden in 25 μl einer Mischung aus 100 % Acetonitril und Reinstwasser im Verhältnis 2:1 (v/v) gelöst. Zentrifugieren Sie dann 5 Minuten lang bei 134 × g (4 °C) und laden Sie 10 μl der markierten N-Glykane in die UPLC-Geräte.
3. Trennen Sie die markierten N-Glykane bei einer Flussrate von 0,4 ml/min mit einem linearen Gradienten von 75 % bis 62 % Acetonitril für 25 min. Führen Sie dann einen Analyselauf mit einer Dextran-Kalibrierleiter/Glykopeptidsäule auf einem UPLC bei 60 °C durch (hier wurden die Proben vor der Injektion bei 4 °C aufbewahrt).
4. Detektion von N-Glykan-Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 330 nm bzw. 420 nm.
5. Integrieren Sie die Glykane basierend auf der Spitzenposition und der Retentionszeit.
6. Berechnen Sie den relativen Wert jedes Glykan-Peaks (GP)/ aller Glykan-Peaks (GPs) (Prozentsatz, %) wie folgt: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100 usw.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Aminobenzamid, 2-AB	Sigma, China
Acetonitril	Huihai Keyi Technology Co., Ltd., China
Ammoniumformiat	Verifizierter Lieferant - Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Dextran-Kalibrierleiter/Glykopeptid-Säule	Watts Technology Co., Ltd, China
Befähigung 3.0	Waters Technology Co., Ltd, Amerika
GlycoProfile 2-AB Markierungskit	Sigma, China
Methanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd., China
Milli-Q Reinwasser-Messgerät	Millipore Co., Ltd, Amerika	202-2AB
Transfer-Flüssigkeitspistole	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China	Vorteil A10
Ultra-Tieftemperatur-Kühlschrank	Thermo Co., Ltd, Amerika	PB-10
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie	Watts Technology Co., Ltd, China
Vakuumpumpe	Watts Technology Co., Ltd, China	4672100, 0,5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl