Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie: Eine robuste Methode zur Quantifizierung von fluoreszenzmarkierten und derivatisierten Sialinsäuren, die aus Mausleber isoliert wurden

Abstract

Quelle: Cao, C. et al. Bestimmung von Sialinsäuren in Leber- und Milchproben von Wildtyp- und CMAH-Knock-out-Mäusen.J. Vis. Exp.(2017)

In diesem Video demonstrieren wir den Nachweis von Sialinsäuren, N-Acetylneuraminsäure und N-Glykolylneuraminsäure unter Verwendung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, HPLC, nach der Derivatisierung mit einem geeigneten Fluoreszenzmarkierungsreagenz zur Unterstützung der Fluoreszenzdetektion.

Protocol

1. Fluoreszenzderivatisierung von Sialinsäuren

1. Bereiten Sie 10 ml OPD-Lösung vor, bestehend aus 100 mg o-Phenylendiamin und 208 mg Natriumhydrogensulfit in 10 ml destilliertem H₂O.
2. Geben Sie 20 μl OPD-Lösung zu den Sialinsäureproben. 30 s lang kräftig vortexen und die Proben 4 h bei 80 °C im Dunkeln inkubieren (d. h. die Mikroröhrchen in Alufolie einwickeln).
3. Lassen Sie die Proben 5 min abkühlen, fügen Sie 80 μL destilliertes H₂O hinzu und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 14.000 x g für 1 min.
4. Übertragen Sie 80 μl aus dem Überstand in ein 300 μl HPLC-Fläschchen mit hoher Rückgewinnung. Die derivatisierten Sialinsäure-Proben können bis zu einer Woche bei 4-6 °C gelagert werden.

2. HPLC-Analyse von Sialinsäurederivaten

1. Analysieren Sie die Proben mit einem Standard-HPLC-System, das mit einem Online-Fluoreszenzdetektor verbunden ist.
2. Verwenden Sie für die Analyse eine Umkehrphasensäule C18 mit den Standardabmessungen von 250 mm Länge und 4,6 mm Durchmesser.
3. Bereiten Sie Lösungsmittel A vor, indem Sie 200 mL Stammlösung mit 800 mL Wasser in LCMS-Qualität (LCMS - Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie) verdünnen. Die Stammlösung selbst kann wie folgt hergestellt werden:
   1. Fügen Sie 46 g Ameisensäure zu 800 ml H₂O in LCMS-Qualität hinzu.
   2. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,5 ein, indem Sie tropfenweise Ammoniumhydroxidlösung (puriss. p.a.) hinzufügen.
   3. Füllen Sie das Lösungsmittel in einen Messzylinder und füllen Sie bis zu 1.000 mL mit H₂O in LCMS-Qualität. Diese Stammlösung kann bis zu 3 Monate bei 4-6 °C gelagert werden.
4. Verwenden Sie für Lösungsmittel B Acetonitril in LCMS-Qualität.
5. Trennen Sie die Sialinsäurederivate bei einer Flussrate von 1 ml/min mit der folgenden Gradientenelution:
   1. Beginnen Sie mit der Zugabe von 10 % Lösungsmittel B gemischt zu Lösungsmittel A.
   2. Erhöhen Sie von 0 min bis 15 min allmählich den Anteil von Lösungsmittel B mit einem linearen Gradienten auf 60%.
   3. Erhöhen Sie den Anteil von Lösungsmittel B mit einem linearen Gradienten von 15 min auf 16 min schnell von 60 % auf 90 %. Dadurch wird das Waschen der HPLC-Säule eingeleitet.
   4. Um die HPLC-Säule weiter zu waschen, halten Sie den Gehalt an Lösungsmittel B zwischen 16 min und 18 min bei 90 %, bevor Sie den Gehalt an Lösungsmittel B zwischen 18 min und 19 min wieder auf 10 % reduzieren.
   Die
   5. HPLC-Säule zwischen 19 und 24 min wieder auf die Startbedingungen von 10% B ausbalancieren.
6. Injizieren Sie 50 μl Probe in das HPLC-System.
7. Überwachen Sie Eluenten mit den Anregungs-/Emissionswellenlängen des Fluoreszenzdetektors von 373/448 nm, und die derivatisierten Sialinsäuren können bei den ungefähren Retentionszeiten von 9 min (für Neu5Gc-OPD) und 10 min (für Neu5Ac-OPD) erwartet werden.
8. Berechnen Sie die relative Menge an Neu5Gc (F_Neu5Gc) aus den Fluoreszenzpeakflächen von Neu5Ac (A_Neu5Ac) und Neu5Gc (A_Neu5Gc) wie folgt:
   F_Neu5Gc [%] = 100×A_Neu5Gc/(A_Neu5Ac+A_Neu5Gc). Im Falle der Milch- und Leberproben der homozygoten Cmah-Knock-out-Maus F_Neu5Gc sollte 0 % betragen, während die Werte für F_Neu5Gc von heterozygoten und Wildtyp-Mäusen je nach Alter und Gewebetyp der Maus stark variieren können (zwischen 2 % und >90 %) mit erwarteten Fehlermargen von ±12 %).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemikalien
N-Acetylneuraminsäure	Sigma	Nr. A0812
N-Glykolylneuraminsäure	Sigma	Artikel-Nr.: 50644	1 mg Aliquot sollte ausreichend sein
O-Phenylendiamin	Sigma	694975
Natriumhydrogensulfit	J&K Scientific GmbH	Artikel-Nr.: 75234
HPLC-Analyse
HPLC-Fläschchen mit hoher Rückgewinnung	Agilent Technologien	#5188-2788
HPLC-System	Shimadzu	Nexera
Fluoreszenzdetektor für die HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
HPLC-Säule	Phenomenex	Hyperklon ODS	250 x 4,6 mm
LCMS-Sorte H2O	Merck Millipore	#WX00011
Acetonitril in LCMS-Qualität	Merck Millipore	#100029	Hypergrade
Ammoniumhydroxid-Lösung	Fluka	#44273	Puriss. p.a.