Der Virus-like Particles Capture Assay: Eine Methode zur Isolierung von Antigen-anzeigenden VLPs aus einer Probe unter Verwendung von neutralisierenden Antikörper-konjugierten magnetischen Beads

Zusammenfassung

Quelle: Rosengarten, J. F., et al. Nachweis von neutralisationsempfindlichen Epitopen in Antigenen, die auf virusähnlichen Partikeln (VLP)-basierten Impfstoffen angezeigt werden, unter Verwendung eines Capture-Assays. J. Vis. Exp. (2022).

In diesem Video zeigen wir einen Immunpräzipitationsassay, den sogenannten VLP-Capture-Assay, um antigenanzeigende virusähnliche Partikel (VLPs) aus einer Probe zu isolieren. Das Antigen bindet an spezifische Antikörper, die an magnetische Kügelchen gebunden sind, und bildet einen immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplex, der später getrennt und für die weitere Analyse gelagert wird.

Protokoll

1. Probenvorbereitung

1. Die Suspensionszelllinien des VLP-Produzenten, die von 293-F-Zellen abgeleitet sind, die HIV-Strukturgene exprimieren, würgen allein oder zusammen mit env bei einer niedrigen Zelldichte von 0,5 x 10⁶ Zellen pro ml in 293-F-Expressionsmedium.
2. Lassen Sie sie 3-4 Tage lang bei 37 °C und 8 % CO₂ in einer Schüttel-Inkubatorrotation mit einer Umlaufbahn von 5 cm und 135 Umdrehungen pro Minute (U/min) expandieren.
3. Pelletieren Sie die Produzentenzellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 5 min. Filtrieren Sie den geklärten Überstand, um Restzellen und Zelltrümmer mit 0,45 μm Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranspritzenfiltern zu entfernen, um einen zellfreien Zellkulturüberstand (CFSN) zu erhalten.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. CFSN kann über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
4. Verwenden Sie entweder das CFSN direkt für das Experiment oder pelletieren Sie VLPs aus 35 mL CFSN mittels Ultrazentrifugation (112.700 x g, 4 °C, 1,5 h).
5. Nach der Ultrazentrifugation wird der Überstand verworfen und die VLP-Pellets in 200 μl 15%iger (w/v) Trehaloselösung pro Zentrifugenröhrchen suspendiert.
   HINWEIS: Das VLP-Pellet ist oft mit bloßem Auge nicht sichtbar. Das Protokoll kann hier pausiert werden. VLPs können bei –80 °C gelagert werden.
6. Bestimmen Sie vor dem VLP-Capture-Assay die Konzentrationen des viralen Kernproteins in den VLP-haltigen Proben mit einem ELISA. Dieser Schritt ist wichtig, um die Eingabe des Capture-Assays zu standardisieren.

2. VLP-Capture-Assay

HINWEIS: Eine Übersicht über den Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Suspendieren Sie die magnetischen Kügelchen, indem Sie entweder auf und ab pipettieren oder mindestens 5 Minuten lang auf einem Rotator bei 50 U/min mischen.
2. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Antikörperlösung vor, die die bNAbs enthält. Pro Reaktion werden 10 μg von jedem bNAb in 200 μl Antikörperbindungs- und Waschpuffer (siehe Materialtabelle) verwendet.
   HINWEIS: Die Antikörpermengen können je nach Affinität des bNAb und der Antigendekorationsdichte der verwendeten VLPs variieren.
3. Verwenden Sie 50 μl der magnetischen Bead-Lösung (siehe Materialtabelle) pro Reaktion und geben Sie die Beads in ein 1,5 mL Reaktionsröhrchen. Legen Sie die Röhrchen auf das magnetische Trenngestell.
   HINWEIS: Alternativ kann für jedes Rohr ein starker Einzelmagnet verwendet werden, um die Kügelchen vom Überstand zu trennen.
4. Warten Sie ein paar Minuten, bis sich die Perlen an der Tubenwand sammeln, um sicherzustellen, dass alle Perlen gesammelt sind. Entfernen Sie den Überstand.
5. Entfernen Sie den Magneten und suspendieren Sie die Kügelchen in 200 μl der in Schritt 2.2 hergestellten bNAb-Lösung. 30 min bis 3 h inkubieren und auf einem Rotator bei 50 U/min bei Raumtemperatur mischen.
6. Legen Sie die Reaktionsgefäße wieder in das magnetische Trenngestell, warten Sie und entfernen Sie den Überstand.
7. Entfernen Sie die Röhrchen vom Magneten und waschen Sie die Kügelchen, indem Sie sie in 200 μl Antikörperbindungs- und Waschpuffer resuspendieren.
8. Wiederholen Sie Schritt 2.4. Entfernen Sie so viel Waschpuffer wie möglich.
9. Geben Sie die Proben in die perlengebundene bNAbs.
   HINWEIS: Die VLP-Eingabe für den Capture-Assay mit HIV-abgeleiteten Partikeln sollte mindestens 15 ng virales Kernprotein pro Reaktion betragen. Die VLP-Mengen können je nach Affinität des bNAb und der Antigendekorationsdichte der verwendeten VLPs variieren.
10. Wenn das in Schritt 2.9 hinzugefügte Probenvolumen unter 1 ml liegt, fügen Sie PBS hinzu, um das Probenvolumen auf 1 ml einzustellen. Hängen Sie die Kügelchen vorsichtig durch Pipettieren auf.
11. Inkubieren Sie die Proben und Kügelchen 2,5 Stunden lang auf einem Rotator bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen in Suspension bleiben und die Lösung während der Inkubation gründlich gemischt wird.
12. Setzen Sie die Röhrchen auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand.
13. Waschen Sie die magnetischen Kügelchen, indem Sie sie in 200 μl Waschpuffer suspendieren (siehe Materialtabelle). Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
14. Suspendieren Sie die Kügelchen in 100 μl Waschpuffer und geben Sie die Suspension in ein sauberes (hitzebeständiges) Reaktionsröhrchen.
15. Legen Sie das Rohr auf das magnetische Trenngestell (siehe Materialtabelle) und entfernen Sie den Überstand vollständig.
16. Bereiten Sie denaturierte SDS-PAGE-Proben gemäß den Schritten 2.16.1 bis 2.16.2 oder nicht denaturierte Proben vor, indem Sie die VLPs von den magnetischen Beads gemäß den Schritten 2.16.3 bis 2.16.5 eluieren.
    1. Zur Herstellung von denaturierten SDS-PAGE-Proben werden die Kügelchen in 20-80 μl Laemmli-Puffer (0,8 μl Laemmli-Puffer pro 1 ng p55-Gag-Assay-Input) suspendiert und 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert.
    2. Fahren Sie direkt mit SDS-PAGE fort oder lagern Sie die Proben bei -20 °C.
       ACHTUNG: Laemmli-Puffer enthält 2-Mercaptoethanol und Natriumdodecylsulfat. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Augenschutz. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen und Kleidung. Atmen Sie keine Dämpfe ein. Arbeiten Sie in einem gut belüfteten Raum, z. B. in einem Abzug.
       HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
    3. Alternativ können Sie einen nicht-denaturierenden Elutionsschritt durchführen, um VLPs mit erhaltener nativer Proteinstruktur zu erhalten.
    4. Geben Sie 25 μl Elutionspuffer (häufig mit den Kügelchen geliefert) zu den magnetischen Kügelchen und inkubieren Sie sie 2-5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    5. Entfernen Sie die Kügelchen und geben Sie das Eluat in ein sauberes Röhrchen. Verwenden Sie das Eluat für nachfolgende Assays oder lagern Sie es bei 4 °C.
       HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte des VLP-Capture-Assays unter Verwendung zellfreier Überstände. (1) Der VLP-Capture-Assay beginnt mit der Bindung des HIV-1-bNAbs an die G-gekoppelten magnetischen Proteinkügelchen. In der Zwischenzeit wird die VLP-Lösung mit einer definierten p55-Konzentration hergestellt. Der zellfreie Kulturüberstand besteht aus eine...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Reaktionsgefäße	Eppendorf
10x PBS	Gibco	70011044
Antikörper (bnAbs)	Polymun Scientic
Dynabeads Protein G Immunpräzipitations-Kit	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007D	Enthält Puffer und Wasch Lösungen
FreeStyle 293-F Zellen	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	Nr. R790-07
FreeStyle 293 Ausdruck Medium	Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
Magnetisches Trenngestell	Neuengland Biolabore	Nr. S1509S	für 12 x 1,5 mL oder 6 x 1,5 mL Röhrchen
Optima XE-90 Ultrazentrifuge	Beckman Coulter
Polyvinylidenfluorid (PVDF) Spritzenvorsatzfilter, 0,45 μm	Carl Roth	KC89.1
PVDF-Transfermembran, 0,45 μm	Carl Roth	T830.1
QuickTiter HIV p24 ELISA	Zell-Biolabore	VPK-108-H
rotator	Heidolph	REAX2
SW28 Rotor	Beckman Coulter
Thermomixer	Cel Medien	grundlegend
Trehalose-Dihydrat	Carl Roth	8897.2
Ultraklare Zentrifugenröhrchen	Beckman Coulter	344058