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1. Funktionalisierung des Arrays mit dem biotinylierten Antikörper
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
- T50 Buffer, eine Lösung aus 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 50 mM NaCl. Die Lösung ist bei RT 1 Monat lang stabil.
- T50-BSA durch Ergänzung des T50-Puffers mit 0,1 mg/ml BSA. Bewahren Sie die vorbereitete Lösung auf Eis auf.
- 10 mg/ml Natriumborhydrid (NaBH4) in 1x PBS. Bereiten Sie diese unmittelbar vor Gebrauch vor.
- 0,2 mg/ml NeutrAvidin (siehe Materialtabelle) in T50-Puffer.
Vorsicht: NaBH4 ist ein Reduktionsmittel und brennbar. Spülen Sie den Behälter nach Gebrauch immer mit Stickstoffgas und lagern Sie ihn in einem Exsikkator.
- Funktionalisieren Sie das Array mit dem biotinylierten Antikörper.
- Nehmen Sie die PEG-Biotin-funktionalisierten Arrays aus dem Gefrierschrank und äquilibrieren Sie das konische Röhrchen vor dem Öffnen auf RT. Legen Sie das Deckglas mit dem Array nach oben auf eine mit Siegelfolie ausgekleidete 100-mm-Gewebekulturschale (TC100).
Anmerkung: Minimieren Sie die Deckenbeleuchtung. Alle Lösungen sollten auf den Quadraten, die durch das hydrophobe Array definiert sind, "abperlen". Fügen Sie ein angemessenes Volumen der Lösung hinzu, um jedes Quadrat vollständig zu bedecken (typischerweise 10-15 μl) und lassen Sie die Flüssigkeit nicht über den definierten Raum laufen. Um Flüssigkeiten schnell zu entfernen, verwenden Sie eine hauseigene Vakuumleitung, die an einer Isolierflasche befestigt ist, um den Abfall aufzufangen. Lassen Sie NaBH4 vor der Entsorgung 1 h lang entgasen, indem Sie das Rohr in der chemischen Abzugshaube offen lassen. Eine NaBH4-Behandlung ist notwendig, um die Hintergrund-Autofluoreszenz zu reduzieren und dadurch falsch-positive Einzelmolekülnachweise zu reduzieren.
- Behandeln Sie jedes Quadrat des Arrays mit 10 mg/ml NaBH4 in 1x PBS für 4 min bei RT. Dreimal mit PBS waschen.
- Jedes Quadrat wird 5 Minuten lang mit 0,2 mg/ml NeutrAvidin in T50 inkubiert. Dreimal mit T50-BSA.
waschen
Anmerkung: NeutrAvidin bindet an PEG-Biotin und stellt eine Bindungsstelle für biotinylierte Antikörper dar.
- Jedes Quadrat wird 10 Minuten lang mit 2 μg/ml biotinyliertem POI-spezifischem Antikörper in T50-BSA inkubiert; dreimal mit T50-BSA.
Anmerkung: Das vorliegende Protokoll verwendet biotinyliertes Anti-EGFR-IgG (siehe Materialtabelle) zur Erfassung von EGFR-GFP.
2. SiMPull von POI aus Ganzzelllysaten
HINWEIS: Stellen Sie die TC100-Schale mit funktionalisierten SiMPull-Arrays für den Rest der SiMPull-Zubereitung auf Eis. Dieser Schritt ist die Extraktion eines POI aus dem Gesamtproteinlysat. Das Lysat darf nach dem Auftauen nicht wiederverwendet werden.
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor.
- Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA)/0,1% Glutaraldehyd (GA) in 1x PBS.
Vorsicht: PFA und GA sind giftige chemische Fixiermittel und potenziell krebserregend. Tragen Sie PSA. Entsorgen Sie die Chemikalien als Sondermüll gemäß den örtlichen Vorschriften und Richtlinien.
- Bereiten Sie 10 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 7,4 vor.
- Tauen Sie das Lysat auf und mischen Sie es, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Bleiben Sie auf Eis.
- 1 μl des Lysats in 100 μl eiskaltes T50-BSA/PPI verdünnen.
Anmerkung: Falls erforderlich, bestimmen Sie den geeigneten Verdünnungsfaktor des Gesamtproteinlysats, indem Sie eine Reihe von Verdünnungen auf das Array anwenden. Die optimale Dichte der SiMPull-Rezeptoren pro Array-Fläche beträgt 0,04-0,08/μm2.
- Inkubieren Sie das Lysat 10 Minuten lang auf dem Array und waschen Sie es dann viermal mit eiskaltem T50-BSA/PPI.
- Verdünnen Sie den AF647-konjugierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (siehe Materialtabelle) in eiskaltem T50-BSA/PPI und inkubieren Sie auf dem Array für 1 h.
Anmerkung: In dem vorliegenden Protokoll wird ein pan-anti-pTyr (PY99)-AF647 IgG verwendet, um die phosphorylierte Population von EGFR-GFP zu identifizieren. Durch die Verwendung von direkt markierten Antikörpern werden keine Sekundärantikörper mehr benötigt, wodurch die Markierungsmöglichkeiten erweitert und die Konsistenz der Ergebnisse verbessert werden. Fluoreszenzmarkierte Antikörper können aus kommerziellen Quellen bezogen werden. Wenn sie nicht im Handel erhältlich sind, können Antikörper mit Standard-Biokonjugationstechniken individuell markiert werden, und kommerzielle Biokonjugationskits sind erhältlich. Jede Charge fluoreszenzmarkierter Antikörper muss auf optimale Markierungsbedingungen getestet werden, indem SiMPull durchgeführt wird, um eine Dosiskurve zu messen und den Sättigungspunkt zu ermitteln.
- Sechsmal mit eiskaltem T50-BSA für insgesamt 6-8 min waschen.
- Zweimal mit eiskaltem 1x PBS waschen.
- Inkubieren Sie das Array 10 Minuten lang mit 4 % PFA/0,1 % GA-Lösung, um eine Dissoziation der Antikörper zu verhindern.
- Zweimal für jeweils 5 min mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,4/PBS waschen, um die Fixiermittel zu inaktivieren.
Anmerkung: Für Experimente mit mehr als einem Antikörper (z. B. Nachweis mehrerer Phosphotyrosinstellen) wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 2.9.
3. Bilderfassung
HINWEIS: Die Einzelmolekül-Bilderfassung wird mit einem 150x TIRF-Objektiv und einem Bildsplitter durchgeführt, der jeden Spektralkanal in einem bestimmten Quadranten der emCCD-Kamera erfasst (siehe Materialtabelle). Kalibrierungsbilder werden zunächst aufgenommen, um die Kanalregistrierung und die Kalibrierung der Kameraverstärkung mit einem nanostrukturierten Kanalausrichtungsgitter (Nanogitter) zu ermöglichen, das 20 x 20 Arrays von 200 ± 50 nm Löchern in einem Intralochabstand von 3 ± 1 μm (Gesamtgröße ~60 μm × 60 μm) enthält.
- Führen Sie die Kanalregistrierung mit den folgenden Schritten durch.
Anmerkung: Eine genaue Kanalregistrierung ist erforderlich, um die Kolokalisierung von Emittern richtig zu berechnen. Dieser Schritt ist entscheidend.
- Reinigen Sie das Ölobjektiv und geben Sie einen Tropfen Öl auf das Objektiv. Platzieren Sie das Nanogitter für die Bildgebung auf dem Tisch. Fokussieren Sie sich mit weißem Durchlicht auf das Gittermuster.
Anmerkung: Bilder mit dem Nanogitter werden mit Hilfe von Durchlicht aufgenommen, das das Nanogitter durchdringt und in allen Spektralkanälen detektiert wird. Alternativ kann man mehrfluoreszierende Kügelchen verwenden, die in jedem Kanal detektierte Fluoreszenz emittieren. Die Bildaufnahme muss je nach Mikroskopkonfiguration optimiert werden.
- Erfassen Sie eine Serie von 20 Bildern des Rasters. Stellen Sie sicher, dass die Pixel nicht gesättigt sind. Speichern Sie die Bildserie als "Fiducial".
- Defokussieren Sie das Nanogitter, um ein luftiges Muster zu erzeugen. Erfassen Sie eine Serie von 20 Bildern für die Verstärkungskalibrierung. Speichern Sie das Bild als "Gain".
- Erfassen Sie eine Serie von 20 Bildern für den Kameraversatz, indem Sie verhindern, dass jegliches Licht auf die Kamera gelangt. Speichern Sie das Bild als "Hintergrund".
- SiMPull-Bilder erfassen.
Anmerkung: Bevor Sie das Deckglas-Array abbilden, tauschen Sie die Tris-Lösung gegen T50-BSA aus und äquilibrieren Sie das Array auf RT.
- Reinigen Sie das Ölobjektiv und tragen Sie zusätzliches Öl auf das Objektiv auf. Befestigen Sie das Deckglas-Array auf dem Mikroskoptisch.
- Optimieren Sie die Anregungsleistung, den TIRF-Winkel und die Kameraintegrationszeit jedes Fluorophors. Ziel ist es, das höchste Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen und gleichzeitig das Photobleaching der Probe zu minimieren. Zeichnen Sie die Laserleistung auf, um die Konsistenz bei zukünftigen Messungen zu gewährleisten.
Anmerkung: In der vorliegenden Studie wurde eine Belichtungszeit von 300 ms für den dunkelroten Kanal und 1 s für den grünen Kanal verwendet. Der 642-nm-Laser wurde mit einer Laserleistung von etwa 500 μW verwendet, während der 488-nm-Laser mit 860 μW verwendet wurde, gemessen vor der Tubuslinse.
- Erfassen Sie Bilder für jede Probe. Bilden Sie zuerst den dunkelroten Kanal ab, gefolgt von jedem Fluorophor mit niedrigerer Wellenlänge, um das Photobleichen zu reduzieren. Aufgrund des geringen Volumens, das für jede Probe verwendet wird, überprüfen Sie den Pufferstand alle 30-45 Minuten und füllen Sie ihn bei Bedarf auf.