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1. Planare Lipid-Doppelschichten
- Plasmareinigung der Objektträger<br />
Anmerkung: Die Plasmareinigung entfernt organische Verunreinigungen und erhöht die Hydrophilie des Glases, wodurch eine effiziente Lipidadsorption gewährleistet wird. Die folgenden Schritte können sich je nach verwendetem Plasmareiniger und Glasdeckgläsern ändern oder müssen optimiert werden.
- Spülen Sie den Plasmareiniger 5 Minuten lang mit Sauerstoff, um Luft aus den Leitungen und der Kammer zu entfernen. Dadurch soll sichergestellt werden, dass sich beim Betrieb des Plasmareinigers hauptsächlich Sauerstoff in den Leitungen und in der Kammer befindet, was zu gleichmäßigeren Doppelschichtpräparaten führt.
- Während des Spülvorgangs wird ein Inertgas wie N2 oder Ar über die Objektträger des Mikroabdeckglases geströmt, um Staub und Partikel zu entfernen.
wahlfrei: Objektträger aus Deckglas können gewaschen werden, indem jede Seite mit 100 % Isopropanol und anschließend mit Wasser besprüht wird. Wiederholen Sie die Isopropanol-Wasserwäsche 3x und trocknen Sie dann mit einem N2 Strahl.
- Ordnen Sie die trockenen Objektträger in einer Keramikschale an. Platzieren Sie die Halterung so an der Rückseite der Plasmakammer, dass die Deckgläser parallel zur langen Kante der Kammer sind (so bleiben sie während der Plasmareinigung an Ort und Stelle). Lassen Sie den Plasmareiniger 15 Minuten lang mit Sauerstoff bei maximaler Leistung laufen.
- Vorbereitung der Kammer
Anmerkung: Das hier beschriebene Verfahren verwendet selbstgemachte Kammern aus PCR-Kunststoffröhrchen zur Unterstützung der Reaktionsvolumina, aber auch andere Materialien mit geringer Adhäsion, wie z. B. Silikon-Wells, können geeignet sein.
- Schneiden Sie mit einer Rasierklinge oder einer Schere die Kappe direkt unter dem mattierten Teil eines 0,2-ml-PCR-Röhrchens ab (Abbildung 1).
- Streichen Sie den Rand des PCR-Röhrchens mit UV-aktiviertem Klebstoff und vermeiden Sie dabei das Innere des Röhrchens. Legen Sie den Kleber des PCR-Röhrchens vorsichtig in die Mitte eines plasmagereinigten Deckglases.
Anmerkung: Um Klebstoff in der Kammer zu vermeiden, verwenden Sie die minimale Menge an Klebstoff, um eine Abdichtung zu erhalten, und behandeln Sie sie sofort mit UV-Strahlung, ohne die Kammer zu stoßen oder zu stören.
- Halten Sie die Kammer 5-7 Minuten lang langwelligem UV-Licht aus, um den Klebstoff auszuhärten.
- Bilayer-Formation
Anmerkung: Monodisperse SUVs sollten in diesem Schritt für eine effiziente Doppelschichtbildung verwendet werden. Tabelle 1 enthält Rezepturen für alle Puffer, die bei der Doppelschichtbildung verwendet werden, einschließlich der Stamm- und Endpufferkonzentrationen.
- Fügen Sie 40 μl unterstützten Lipid-Doppelschichtpuffer hinzu (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabelle 1), 10 μl 5 mM SUVs und 1 μl 100 mM CaCl2 in die Vertiefung. Schütteln Sie die Kammern vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die SUVs zu stören, und inkubieren Sie dann bei 37 °C für 20 min.
Anmerkung: Um die Verdunstung zu begrenzen, in einer abgedeckten Petrischale mit einem feuchten Tuch inkubieren.
- Überschüssige Lipide wegspülen
Anmerkung: Dieser Schritt entfernt überschüssige SUVs und dient als Pufferaustauschschritt. Es ist sehr wichtig, die Doppelschicht beim Waschen nicht mit der Pipettenspitze abzukratzen. Wird das Glas freigelegt, binden sich Septine und viele andere Proteine irreversibel und verringern die effektive Proteinkonzentration.
- Spülen Sie die Doppelschicht nach der Inkubation 6x mit 150 μl SLBB und pipetieren Sie jedes Mal auf und ab, um sie zu mischen, ohne Blasen zu bilden.
HINWEIS: Fügen Sie 150 μl direkt zu den 50 μl Puffer und SUVs hinzu, die bereits vorhanden sind, um insgesamt 200 μl in der Reaktionsvertiefung zu erhalten.
- Wenn Sie bereit sind, mit den Septinen oder einem anderen Protein Ihrer Wahl zu inkubieren, waschen Sie die Doppelschicht 6x mit 150 μl Reaktionspuffer (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg/mL BSA, 0,14 % Methylcellulose, 1 mM BME).
HINWEIS: Um beste Ergebnisse zu erzielen, machen Sie den Reaktionspuffer frisch und seien Sie sehr vorsichtig, während Sie die Reaktion gut einmischen, um Blasen zu vermeiden.
- Entfernen Sie im letzten Waschschritt 125 μl Reaktionspuffer und lassen Sie 75 μl in der Vertiefung. 25 μl Septine, verdünnt in Septin-Lagerpuffer (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME), in der gewünschten Konzentration zugeben und mittels TIRF-Mikroskopie abbilden.
Anmerkung: Wenn Sie diesen Assay zum ersten Mal einrichten oder eine neue Lipidzusammensetzung einbeziehen, empfiehlt es sich, mithilfe der Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) sicherzustellen, dass die Lipide frei auf der Oberfläche diffundieren. Während die Rückgewinnungsrate für verschiedene Lipidzusammensetzungen unterschiedlich und von Natur aus niedriger ist als bei freistehenden Systemen, sollten die Lipide nicht unbeweglich sein.
Tabelle 1: Pufferkomponenten zur Vorbereitung der unterstützten Lipiddoppelschicht und Reaktionen. Die Volumina der Stammlösungen, die in die Puffer eingearbeitet werden, und die Endkonzentrationen der einzelnen Komponenten sind dargestellt. SLB und PRB können bei Raumtemperatur gelagert und zwischen den Experimenten wiederverwendet werden. Reaktionspuffer und SSB werden für jedes Experiment frisch gemacht.
kg
| Unterstützter Lipid-Doppelschichtpuffer (SLBB) |
| Lager | Volumen | Endkonzentration |
| 2 M KCl | 1,5 mL | 300 mM |
| 1 M HEPES | 200 μL | ca. 20 mM |
| 500 mM MgCl2 | ca. 20 μl | 1 mM |
| Wasser | 8 mL | |
| Vorreaktionspuffer (PRB) |
| Lager | Volumen | Endkonzentration |
| 2 M KCl | 166 μL | 33,3 Mio. m |
| 1 M HEPES | 500 μL | 50 mM |
| Wasser | 9,33 mL | |
| Reaktionspuffer |
| Lager | Volumen | Endkonzentration |
| 2 M KCl | 166 μL | 33,3 Mio. m |
| 1 M HEPES | 300 μL | 50 mM |
| 10 mg/ml BSA | 1,39 mL | 1,39 mg/ml |
| 1% Methylcellulose | 1,39 mL | 0,0014 |
| Wasser | Bis zu 10 mL | |
| Bme | 0,7 μl | 1 mM |
| Septin Storage Buffer (SSB) |
| Lager | Volumen | Endkonzentration |
| 2 M KCl | 1,5 mL | 300 mM |
| 1 M HEPES | 500 μL | 50 mM |
| Wasser | Bis zu 10 mL | |
| Bme | 0,7 μl | 1 mM |
