Sphärisch gestützter Lipid-Doppelschicht-Assay: Eine Technik zur Beobachtung der Septin-Assemblierung auf Mikrosphären

Zusammenfassung

Quelle: Curtis, B. N. et al., Rekonstitution der Septin-Assemblierung an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video beschreibt die Technik zur Untersuchung der Septin-Protein-Assemblierung auf Mikrosphären, die mit Lipiddoppelschichten beschichtet sind. Diese Technik hilft beim Verständnis der krümmungsabhängigen Anordnungen von Proteinen auf gekrümmten Oberflächen.

Protokoll

1. Kugelgestützte Lipiddoppelschichten

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet Siliziumdioxid-Mikrosphären, die in Reinstwasser mit einer Dichte von 10% suspendiert sind. Bei allen Arbeiten zu den kinetischen Parametern der Proteinassemblierung ist es wichtig, die Gesamtmembranoberfläche zwischen den Experimenten und Krümmungen streng zu kontrollieren. Tabelle 1 zeigt die korrigierten Volumina von Kügelchen und Puffern, um 5 mm² der Gesamtmembranoberfläche zu erhalten.

1. Bildung von Doppelschichten
   Anmerkung: Bei planaren Doppelschichten ist es wichtig, hochwertige SUVs für eine robuste Doppelschichtbildung zu haben. Tabelle 1 listet das Volumen der Kügelchen aus einer Lösung mit 10 % Dichte und ihre jeweiligen SLBB-Volumina auf, die verwendet werden, um eine Endoberfläche von 5 mm² für eine Reihe von Perlendurchmessern zu erhalten.
   1. Kieselsäure-Mikrokügelchen (auch als Kügelchen bezeichnet) neigen dazu, sich abzusetzen und zu verklumpen. Um die Kügelchen zu mischen und eventuelle Cluster aufzubrechen, die Flasche 15 s lang vortexen, dann 1 min lang badbeschallen und erneut 15 s vortexen.
   2. Mischen Sie das entsprechende Volumen an Kügelchen (Tabelle 1) mit dem entsprechenden Volumen an SLBB und 10 μl von 5 mM SUVs in einem 0,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adhäsion.
   3. Schütteln Sie das Kügelchen-Lipid-Gemisch 1 h lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass diese Inkubation auf einem Rotator durchgeführt wird, um eine Sedimentation zu verhindern.
2. Kammern auf PEGylierten Deckgläsern vorbereiten
   Anmerkung: Bei planaren Doppelschichten werden hausgemachte Kammern aus PCR-Kunststoffröhrchen verwendet, um die Reaktionsvolumina zu unterstützen, aber auch andere Materialien mit geringer Adhäsion, wie z. B. Silikon-Wells, können genauso gut funktionieren.
   1. Während die Perlen schaukeln, tauen Sie ein PEGyliertes Deckglas bei Raumtemperatur auf. Schneiden Sie ein 0,2 mL PCR-Röhrchen ab und kleben Sie es wie beschrieben auf das Deckglas. Bei Objektträgern von 24 mm x 50 mm passen bis zu 10 Kammern auf einen Objektträger.
      Anmerkung: Dieses Protokoll verwendet 24 mm x 50 mm PEGylierte Glasdeckgläser, die im Voraus vorbereitet werden. Kurz gesagt, Glasdeckgläser werden durch Beschallung in Aceton, Methanol und 3 M KOH gründlich gereinigt. Deckgläser werden dann mit n-2-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilan funktionalisiert und kovalent an mPEG Succinimidylvalerat gebunden. Fertige PEGylierte Deckgläser werden vakuumversiegelt bei −80 °C gelagert. Während hier PEGylierte Glasdeckgläser empfohlen werden, können auch andere Mittel der Passivierung, wie z. B. BSA- oder Poly-L-Lysin-Verfahren, wirksam sein.
3. Überschüssige Lipide wegspülen
   Anmerkung: Dieser Schritt dient dazu, überschüssige SUVs zu entfernen und einen Puffertausch durchzuführen. Die Kügelchen werden insgesamt 4x mit einem Vorreaktionspuffer gewaschen (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). Tabelle 2 listet die Schleuderdrehzahlen in RCF für eine Reihe von Perlendurchmessern auf.
   1. Die Perlen drehen sich 30 s lang bei der vorgesehenen RCF (Tabelle 2). Wenn Sie mehrere Perlengrößen verwenden, lassen Sie die Perlen schaukeln, bis es Zeit zum Waschen ist.
      Anmerkung: Es lohnt sich nicht, größere Kügelchen im gleichen Spin wie kleinere Kügelchen mit der geringeren Sedimentationsgeschwindigkeit der Kügelchen zu sedimentieren, um Zeit zu sparen. Dies kann dazu führen, dass die Perlen aneinander haften und die Integrität der Doppelschicht beeinträchtigen.
   2. Nach dem ersten Schleudern 50 μl Überstand entfernen und 200 μl PRB hinzufügen. Entfernen Sie nach der zweiten und dritten Umdrehung 200 μl und fügen Sie 200 μl PRB hinzu. Nach dem vierten Schleudern 200 μl entfernen und 220 μl PRB hinzufügen. Bei jedem Waschgang kräftig pipettieren
      Anmerkung: Das endgültige Resuspensionsvolumen unterscheidet sich von den Waschungen. Wirbeln Sie die Kügelchen nach der Inkubation mit den Lipiden nicht auf, da dies Lücken in den Doppelschichten hinterlassen kann. Um eine Sedimentation bei der Arbeit mit den anderen Bead-Größen oder beim Einrichten anderer Teile des Assays zu vermeiden, setzen Sie die Bead-Mischungen wieder auf den End-over-End-Rotator.
4. Vorbereitung der Reaktion
   1. Wenn Sie einen Wettkampf-Assay mit mehreren Bead-Größen durchführen, stellen Sie eine 1:1-Mischung her, indem Sie gleiche Volumina jeder Bead-Größe miteinander mischen. Mischen Sie dann 29 μl der gewünschten Bead-Mischung (oder einer einzelnen Bead) mit 721 μl RXN-Puffer.
      Anmerkung: Es ist wichtig, die Kügelchen bei jedem Schritt gründlich mit einer Pipette zu mischen, um dichte Kügelchenhaufen zu vermeiden. Dies führt zu einer gleichmäßigeren Raupenverteilung und einer genauen Gesamtoberfläche.
   2. Mischen Sie 75 μl verdünnte Kügelchen und 25 μl in SSB verdünntes Protein in die Vertiefungen.
      Anmerkung: Die Autoren bilden Hefe-Septin-Komplexe typischerweise bei 1-50 nM ab.
   3. Wenn Sie Septine im stationären Zustand messen, inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur und bilden Sie sie dann entweder mit einer nahen TIRF- oder einer konfokalen Mikroskopie ab.
      Anmerkung: Diese Reaktion ist so konzipiert, dass die gesamte Membranoberfläche der Reaktion bei 5 mm² erhalten bleibt und eine endgültige Reaktionsbedingung von 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0,1 % Methylcellulose und 1 mM BME erzeugt wird.

Tabelle 1: Normalisierte Volumina von Mikrokügelchen. Um eine gleiche Oberfläche jeder Kügelchengröße zu erhalten und die Gesamtmembranoberfläche zwischen den Experimenten konsistent zu halten, wurden die Volumina für jede Kügelchengröße und jeden Puffer berechnet, die die Gesamtoberfläche normalisierten.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Durchmesser der Raupe (μm)	Volumen der gut gemischten Kügelchen (μL)	Volumen des SLB-Puffers (μL)	Volumen von SUVs (μL)
6,46	8,94	61,1	10
5,06	7	63	10
3,17	4,39	65,6	10
0,96	1,33	68,7	10
0,54	0,75	69,3	10
0,31	0,43	69,6	10

Tabelle 2: Sedimentationsgeschwindigkeiten für Mikrokügelchen mit unterschiedlichen Durchmessern. Für jeden Kügelchendurchmesser wurden die angegebenen minimalen Sedimentationsgeschwindigkeiten verwendet, um die Kügelchen zum Wegspülen ungebundener Liposomen zu pelletieren

kg kg kg kg kg kg kg kg kg

Durchmesser der Raupe (μm)	Sedimentationsgeschwindigkeit (RCF)
0,31	4,5
0,54	4,5
0,96	2.3
3,17	0,8
5,06	0,3

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,2 mL PCR-Röhrchen mit flachem Verschluss, Natur	Watson	137-211C(EX)
0,5 mL Röhrchen mit geringer Haftung	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1405-2600
Beta-Mercaptoethanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr. A4612-25G
Deckglas zur Herstellung von PEGylierten Deckgläsern	Thermo Scientific	Artikel-Nr.: 152450	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Abdeckglas 24x50 #1,5
DOPC	Avanti Polare Lipide	850375
Ei Liss Rhodamin PE	Avanti Polare Lipide	810146
HEPES	Sigma Aldrich	H3375-1KG
Methylcellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	M052-100G
Mini-Zentrifuge
Nicht-funktionalisierte Siliziumdioxid-Mikrosphären	Bangs Laboratories, Inc.	Abhängig von der Größe: SS0200*-SS0500*	Kieselsäure in wässriger Suspension
Optischer Klebstoff	Norland Thorlabs	NOA 68	Flexibler Klebstoff für Glas oder Kunststoff
Kaliumchlorid	VWR	0395-1kg
Sonicator-Bad	Branson	1510R-MT	Bransonic Ultraschallreiniger. 50-60 Hz. Leistung: 70W
Soja PI	Avanti Polare Lipide	840044
Tischzentrifuge	Eppendorf	Artikel-Nr.: 22331
UV-Lampe	Spektroline	ENF-260C	115 Volt, 60 Hz, 0,20 AMPERE