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1. Menschliche Hornhautepithelzellkultur
- Züchten Sie immortalisiertes HCEC in kollagenbeschichteten 75 cm² Kolben mit 20 mL des modifizierten Eagle Medium/Nährstoff-Gemischs F-12 (DMEM/F12) von Dulbecco, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin enthält, bei 37 °C mit 5 % CO2,
HINWEIS: Schütteln ist nicht erforderlich.
- Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage.
2. Vorbereitung der Zellen für den Test
- Nachdem die Zellen fast zusammenfließen, entfernen Sie das Kulturmedium.
- 4-6 ml Zelldissoziationslösung werden in jeden 75 cm² Kolben gegeben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, bis sich die Zellen ablösen (ca. 20-30 Minuten), und überprüfen Sie sie regelmäßig unter dem Mikroskop.
- 2-6 ml DMEM/F12 mit 10 % FBS werden in jeden 75 cm² großen Kolben gegeben.
- Den Inhalt des Kolbens in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen.
- Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 450-500 x g zentrifugiert. Der Überstand wird herauspipetiert und die Zellen werden in einem vorgewärmten Medium resuspendiert.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie das Volumen des Mediums, das insgesamt 1 x 105 Zellen enthält.
- Geben Sie 1 x 105 Zellen in jede Vertiefung einer mit Kollagen-1 beschichteten 48-Well-Kulturplatte. Geben Sie so viel Medium in die Vertiefung, dass das endgültige Medienvolumen in der Vertiefung 0,5 ml Kultur-DMEM/F12 mit 10 % FBS beträgt.
HINWEIS: Eine künstliche Tränenformulierung kann eine Zytotoxizität verursachen, die durch eine Abnahme der metabolischen Aktivität von HCEC gemessen werden kann. Die Konsistenz der Daten hängt davon ab, ob bei der Aussaat in jeder Vertiefung die gleiche Anzahl von HCEC hinzugefügt wird. Die für 48-Well-Platten empfohlene Kulturkonzentration beträgt 1 x 105. Da sich Säugetierzellen nach dem Resuspendieren im Zentrifugenröhrchen absetzen können, wird empfohlen, die Zellen durch häufiges Rühren zu resuspendieren, während die Platten mit Zellen besiedelt werden, so dass die Zellsuspension den HCEC gleichmäßig verteilt.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h.
3. Kein Austrocknungsprotokoll
- Steuerungsverfahren
- Nach der 24-stündigen Inkubation nehmen Sie das Nährmedium von der Platte.
- Sofort mit 150 μl einer Testformulierung und einer Medienkontrolllösung behandeln.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 für 30 min.
- Entfernen Sie die Testlösungen aus den Zellen.
- Fügen Sie 0,5 ml 10% ige metabolische Farbstofflösung hinzu, um die metabolische Aktivität zu testen. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 4 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2
.
- Nach der 4-stündigen Inkubationszeit werden 100 μl metabolische Farbstofflösung aus jeder Vertiefung entnommen und jeweils 100 μl in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte gegeben.
- Messen Sie die Fluoreszenz jeder Vertiefung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät (Materialtabelle). Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 540 nm und die Emissionswellenlänge auf 590 nm ein.
- Kein Austrocknungsprotokoll (Wiederherstellungsverfahren)
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 bis 3.1.4.
- Geben Sie 0,5 ml DMEM/F12-Medium in jede Vertiefung
.
- Inkubieren Sie einen Satz Kulturen 18 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2.
- Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 0,5 ml 10%ige metabolische Farbstofflösung hinzu. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.6 und 3.1.7.