Bimolekulare Komplementationsaffinitätsreinigung zur Isolierung von zwei interagierenden Proteinen

Zusammenfassung

Quelle: Hastings, J. F. et al. Dissektion von Multi-Protein-Signalkomplexen durch bimolekulare Komplementations-Affinitätsreinigung (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video haben wir die bimolekulare Komplementationsaffinitätsreinigung (BiCAP) demonstriert, um spezifische Proteindimere unter Verwendung von konformationsspezifischen Einzeldomänen-Antikörpern nachzuweisen und zu isolieren.

Protokoll

>1. Zellkultur und Transfektion

HINWEIS: Für die Transfektion der BiFC-Vektoren ist es wichtig, eine hohe Effizienz und relativ homogene Transfektion zu erreichen. Die Vektoren sind wahrscheinlich mit jedem Standard-Transfektionsreagenz kompatibel, und die Transfektionsbedingungen sollten entsprechend optimiert werden. Für die Massenspektrometrie kultivieren wir in der Regel Zellen innerhalb von 10-cm-Schalen, obwohl dies für Experimente, die weniger Material benötigen, auch proportional auf kleinere Schalen oder Platten skaliert werden kann.

1. 1,0 × 10⁶ HEK293T Zellen in einer 10 cm großen Schale mit 10 mL DMEM-Medien, ergänzt mit 10 % FBS und Penicillin/Streptomycin (1:100).
2. Verdünnen Sie 2,5 μg jedes BiFC-Vektors in 500 μl Transfektionspuffer (siehe Materialtabelle) in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
3. 10 μl Transfektionsreagenz zugeben (siehe Materialtabelle).
4. Gemisch 10 s vortexen, dann kurz zentrifugieren. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Geben Sie die DNA-Transfektionsmischung tropfenweise auf die Platte. Inkubieren Sie die Zellen für eine ausreichende Zeitspanne, damit die BiFC-Fusionsproteine interagieren können und für die Venusfaltung und die Fluorophorreifung, in der Regel ~8 - 24 h.
   HINWEIS: Die maximale Anregung für die Venus beträgt 515 nm und ihre maximale Emission 528 nm, obwohl dies mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden kann, das zur Visualisierung der GFP-Fluoreszenz eingerichtet ist.

>2. Probenvorbereitung

1. Ernte von Lysaten
   1. Bereiten Sie vor der Lysatgewinnung den Zelllysepuffer vor [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % (v/v) nichtionisches Detergens (siehe Materialtabelle)]. Bei 4 °C lagern.
   2. Unmittelbar vor der Entnahme 10 ml Zelllysepuffer mit Proteaseinhibitor und Phosphataseinhibitor ergänzen (siehe Materialtabelle). Bewahren Sie den ergänzten Zelllysepuffer auf Eis auf.
   3. Waschen Sie die Zellen zweimal in eiskaltem PBS. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 1 ml eiskalten Zelllysepuffer hinzu. Stellen Sie die Schale auf Eis und achten Sie darauf, dass der Puffer über die gesamte Oberfläche verteilt ist.
   4. Inkubieren Sie die Zellen ca. 5 Minuten lang auf Eis, verwenden Sie dann einen Zellschaber (siehe Materialtabelle), um die Zellen abzukratzen und in ein vorgekühltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
   5. Entfernen Sie zelluläre Trümmer, indem Sie das gesammelte Lysat bei 18.000 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den gereinigten Überstand in frische Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
      Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt kann das Lysat sofort verwendet oder bei -80 °C gelagert werden. Es wird auch empfohlen, ein Aliquot von Rohlysat aufzubewahren, damit die Effizienz der Transfektion und der Affinitätsreinigung validiert werden kann.
2. Reinigung der Affinität
   Anmerkung: Der BiCAP-Isolierungsschritt wird mit dem GFP-Nanobody durchgeführt, der an Agarosekügelchen konjugiert ist (siehe Materialtabelle).
   1. Bereiten Sie die Agarosekügelchen vor, indem Sie ein geeignetes Volumen (20 μl pro Probe + 10 μl Überschuss) in 1 ml PBS waschen. Die Kügelchen bei 300 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
   2. Zu jeder Lysatprobe werden 20 μl hinzugefügt.
   3. Inkubieren Sie die Proben 2 h lang bei 4 °C mit End-to-End-Rotation.
      Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben entweder für SDS-PAGE und Western Blotting oder für die Analyse mittels Massenspektrometrie vorbereitet werden.
3. Vorbereitung des BiCAP-Eluenten für das Western Blotting.
   1. Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 300 x g und waschen Sie sie dreimal im Cell Lysis Buffer.
   2. Resuspendieren Sie die gewaschenen Kügelchen in 50 μl entsprechend verdünntem Probenpuffer (siehe Materialtabelle) und erhitzen Sie die Proben bei 95 °C für 2-3 min.
      Anmerkung: Auf diese Weise vorbereitete Proben können mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
   3. Führen Sie SDS-PAGE und Western Blotting sowohl für den V1-Tag als auch für den V2-Tag (siehe Materialtabelle) sowie für alle anderen Proteine von Interesse durch.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Gibco	Nr. 11995-073	Zellkultur
FBS	Life Technologies Australien	Nr. 10099-141	Zellkultur
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies Australien	Tel.: 15070-063	Zellkultur
jetPRIME Transfektionspuffer	Polyplus	Nr. 114-15	Zellkultur
jetPRIME Transfektionsreagenz	Polyplus	Nr. 114-15	Zellkultur
PhosSTOP (Phosphatase-Hemmer)	Sigma-Aldrich	4906837001	Zellkultur
Kompletter, EDTA-freier Mini-Proteasehemmer-Cocktail	Roche	11873580001	Kunststoff-Ware
Zell-Schaber	Sarstedt	Nr. 83.1832
GFK-Trap_A	Chromotek Gmbh	GTA-100	GFP-Nanobody gekoppelt an Agarosekügelchen
Monoklonaler N-terminaler GFP-Antikörper	Sehenswürdigkeit	MMS-118P	Erkennt das V1-Tag innerhalb der BiFC-Vektoren
C-terminaler monoklonaler GFP-Antikörper	Roche	11814460001	Erkennt das V2-Tag innerhalb der BiFC-Vektoren
Proben-Puffer	Invitrogen	Nr. NP0008	Ergänzt mit 1 mL β-Mercaptoethanol.
Modifiziertes Trypsin in Sequenzierungsqualität	Promega Corporation	Nr. V5117H	Zellkultur
LoBind Mikrozentrifugenröhrchen	Point-of-Care-Diagnostik	Tel.: 0030 108 116	Kunststoff-Ware
Jodacetamid	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Hergestellt mit 5 mg/ml in Reinstwasser
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fischer
DH5α-Zellen	Thermo Fischer		Hitzeschock-kompetente Zellen