Bimolekulare Komplementationsaffinitätsreinigung zur Isolierung von zwei interagierenden Proteinen

Abstract

Quelle: Hastings, J. F. et al. Dissektion von Multi-Protein-Signalkomplexen durch bimolekulare Komplementations-Affinitätsreinigung (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

In diesem Video haben wir die bimolekulare Komplementationsaffinitätsreinigung (BiCAP) demonstriert, um spezifische Proteindimere unter Verwendung von konformationsspezifischen Einzeldomänen-Antikörpern nachzuweisen und zu isolieren.

Protocol

>1. Zellkultur und Transfektion

HINWEIS: Für die Transfektion der BiFC-Vektoren ist es wichtig, eine hohe Effizienz und relativ homogene Transfektion zu erreichen. Die Vektoren sind wahrscheinlich mit jedem Standard-Transfektionsreagenz kompatibel, und die Transfektionsbedingungen sollten entsprechend optimiert werden. Für die Massenspektrometrie kultivieren wir in der Regel Zellen innerhalb von 10-cm-Schalen, obwohl dies für Experimente, die weniger Material benötigen, auch proportional auf kleinere Schalen oder Platten skaliert werden kann.

1. 1,0 × 10⁶ HEK293T Zellen in einer 10 cm gro....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	Nr. 11995-073	Zellkultur
FBS	Life Technologies Australien	Nr. 10099-141	Zellkultur
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies Australien	Tel.: 15070-063	Zellkultur
jetPRIME Transfektionspuffer	Polyplus	Nr. 114-15	Zellkultur
jetPRIME Transfektionsreagenz	Polyplus	Nr. 114-15	Zellkultur
PhosSTOP (Phosphatase-Hemmer)	Sigma-Aldrich	4906837001	Zellkultur
Kompletter, EDTA-freier Mini-Proteasehemmer-Cocktail	Roche	11873580001	Kunststoff-Ware
Zell-Schaber	Sarstedt	Nr. 83.1832
GFK-Trap_A	Chromotek Gmbh	GTA-100	GFP-Nanobody gekoppelt an Agarosekügelchen
Monoklonaler N-terminaler GFP-Antikörper	Sehenswürdigkeit	MMS-118P	Erkennt das V1-Tag innerhalb der BiFC-Vektoren
C-terminaler monoklonaler GFP-Antikörper	Roche	11814460001	Erkennt das V2-Tag innerhalb der BiFC-Vektoren
Proben-Puffer	Invitrogen	Nr. NP0008	Ergänzt mit 1 mL β-Mercaptoethanol.
Modifiziertes Trypsin in Sequenzierungsqualität	Promega Corporation	Nr. V5117H	Zellkultur
LoBind Mikrozentrifugenröhrchen	Point-of-Care-Diagnostik	Tel.: 0030 108 116	Kunststoff-Ware
Jodacetamid	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Hergestellt mit 5 mg/ml in Reinstwasser
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fischer
DH5α-Zellen	Thermo Fischer		Hitzeschock-kompetente Zellen