$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Mäusen und DSS
- Halten Sie die Knockout-Mäuse (α-Gustducin-/-) und die auf Alter, Geschlecht und Körpergewicht abgestimmten Wildtyp-Kontrollmäuse (α-Gustducin+/+) C57BL/6 einzeln in sauberen Käfigen.
Anmerkung: Die Knockout-Mäuse werden seit über 20 Generationen mit C57BL/6-Mäusen rückgekreuzt und haben einen nahezu 100%igen genetischen Hintergrund von C57BL/6.
- 30 g Dextransulfat-Natrium (DSS)-Pulver in 1 l autoklaviertem Wasser auflösen. Mischen, bis die Lösung klar wird, um sicherzustellen, dass die endgültige Arbeitskonzentration 3 % (w/v) beträgt.
Anmerkung: Die DSS-Lösung kann bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur oder bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert werden.
>2. Induktion und Bewertung von DSS-Colitis bei Mäusen
- Wiegen und notieren Sie das anfängliche Körpergewicht jeder Maus. Setzen Sie die Mäuse einzeln in handelsübliche Kunststoffkäfige und beschriften Sie die Käfige.
- Ersetzen Sie normales Trinkwasser durch 3%ige DSS-Lösung für insgesamt 7 Tage, zu denen beide Gruppen von Mäusen ad libitum Zugang haben.
- Messen Sie das Körpergewicht der Maus, zeichnen Sie den Verbrauch der DSS-Lösung auf und sammeln und untersuchen Sie täglich den Stuhl jeder Maus während der DSS-Verabreichung. Beobachten Sie die Schwere von Durchfall und rektalen Blutungen und rechnen Sie diese in den DSS-induzierten Krankheitsindex um.
- Während des Experiments werden der prozentuale Gewichtsverlust im Vergleich zum Ausgangsgewicht und der Krankheitsindex berechnet, um die Symptome der Kolitis zu bewerten.
Anmerkung: Der Krankheitsindex wird durch die Kombination von Beobachtungen von Durchfall und rektalen Blutungen bewertet und ist wie folgt definiert: 0 (normaler Stuhl, kein Blut), 1 (weicher Stuhl, kein Blut), 2 (weicher Stuhl, wenig Blut), 3 (sehr weicher Stuhl, leichte Blutung) und 4 (wässriger Stuhl, starke Blutungen). Der Krankheitsindex wird täglich für jede Maus analysiert.
- Am Ende der 7-tägigen DSS-Behandlung töten Sie die Mäuse durch Gebärmutterhalsluxation und fahren Sie mit den verbleibenden Experimenten fort.
>3. Vorbereitung von Gewebeproben
- Bringen Sie die Maus in Rückenlage und reinigen Sie die Haut des Bauches mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer kleinen Schere einen 3 cm langen Schnitt in der Mittellinie, um die Bauchhöhle freizulegen.
- Trennen Sie die Milz vorsichtig mit einer Pinzette von anderen Geweben, entfernen Sie dann die Milz und messen Sie ihre Größe.
- Identifizieren und heben Sie den Dickdarm mit einer Pinzette an und trennen Sie ihn vom umgebenden Mesenterium. Ziehen Sie den gesamten Dickdarm heraus, bis der Blinddarm und der Enddarm sichtbar sind.
- Isolieren Sie den Dickdarm, indem Sie ihn am Kolozökalrand und tief im Becken durchschneiden, um den proximalen bzw. distalen Dickdarm zu befreien. Messen und notieren Sie dann die Länge des isolierten Doppelpunkts. Achten Sie darauf, das Dickdarmgewebe während des Präpariervorgangs nicht zu beschädigen.
- Spülen Sie den Dickdarm mit 10 ml eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer 10-ml-Spritze, die mit einer Sondennadel ausgestattet ist, um den Kot und das Blut zu entfernen, bis das Eluat vollständig frei ist.
- Für die histologische Identifizierung teilen Sie die Gewebeproben gleichmäßig in drei Teile auf: proximal, mittel und distal. Fixieren Sie das Gewebe dann über Nacht mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C.