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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Wachstum und Vorbereitung von bakteriellen Inokula
- Auftauen von Glycerinbeständen von Helicobacter pylori (H. pylori) oder H. felis bei -80 °C und Subkultur auf Pferdeblutagar (HBA)-Platten, bestehend aus: Blut-Agar-Base Nr. 2 (siehe Materialtabelle); ein modifiziertes "Skirrow's Antibiotic Selective Supplement" (bestehend aus Vancomycin, 10 μg/ml; Polymyxin B, 25 ng/ml; Trimethoprim, 5 μg/ml; Amphotericin B, 2,5 μg/ml); und 5–10 % (v/v) Pferdeblut. Die Bakterien wachsen gut unter mikroaeroben Bedingungen in 2,5 oder 3,5 L anaeroben Gläsern, die die entsprechenden Gaspackungen enthalten (siehe Materialtabelle), bei 37 °C.
HINWEIS: H. pylori-Stämme, die unter diesen Bedingungen gezüchtet werden, müssen nach 1–1,5 Tagen Inkubation subkultiviert werden, während für H. felis in der Regel eine mindestens 2-tägige Inkubation erforderlich ist. Geeignete Kultur- und Speichermedien wurden bereits ausführlich beschrieben.
- Bereiten Sie bakterielle Inokula für Mausinfektionen aus Kulturen der frühen bis mittleren logarithmischen Phase vor. Ernten Sie Bakterien schonend aus den Agarplatten, indem Sie jede Platte mit 1–2 ml BHI-Brühe (Brain Heart Infusion) überfluten. Aspirieren Sie Suspensionen von Platten mit Pasteur-Pipetten.
- Alternativ können Sie Inokula aus Helicobacter-Bakterien herstellen, die 16–18 h in BHI-Brühe vermehrt wurden. In diesem Fall werden die Bakterien durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit bei 2.200 x g für 10 min bei 4 °C gesammelt.
- Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit und Beweglichkeit der Bakterien, indem Sie Nasspräparate unter Phasenkontrastmikroskopie (100X-Objektiv) untersuchen. Bereiten Sie Nasshalterungen vor, indem Sie eine Schlaufe voller Bakterien in einem 10–20 μl großen Tröpfchen BHI-Bouillon auf einem Glasobjektträger resuspendieren. Im Fall von H. felis, einem viel größeren Bakterium als H. pylori, verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der lebensfähigen Bakterien genau zu zählen. Bestätigen Sie die Reinheit der Kultur, indem Sie eine Gram-Färbung durchführen.
Anmerkung: Verwenden Sie H. pylori inocula nur, wenn die Mehrzahl der Bakterien eine bazilläre oder spiralförmige Form hat (die Morphologie kann je nach Stamm variieren). H. felis inocula sollte in erster Linie helikale Bakterien enthalten.Verwenden Sie Inocula nicht, wenn die meisten Bakterien eine kokkoide Morphologie aufweisen, da diese Formen nicht lebensfähig sind und bei Mäusen keine Infektion auslösen.
- Schätzen Sie die Anzahl der Bakterien im Inokulum, indem Sie unter Phasenkontrastmikroskopie die ungefähre Anzahl der Bakterien pro Feld (100X-Ziel) zählen und den folgenden Leitfaden verwenden: 1 Bakterium pro Feld = ungefähr 106 koloniebildende Einheiten (KBE) von Helicobacter/ml; 10 Bakterien pro Feld = ungefähr 107 KBE/ml; 100 Bakterien pro Feld = ungefähr 108 KBE/ml, etc.
- Wenn Sie ein Hämozytometer verwenden, berechnen Sie KBE/ml mit der folgenden Formel:
KBE/ml = (durchschnittliche Anzahl von Bakterien in einem Feld von 4 x 4) x (Verdünnungsfaktor) x (10,4).
- Die bakterielle Zelldichte des Inokulums wird bei Bedarf durch Verdünnung in BHI-Brühe auf ca. 107–108 KBE/ml eingestellt.
- Um eine maximale Lebensfähigkeit der Bakterien zu gewährleisten, verwenden Sie Inokula für die Magensonde so bald wie möglich nach der Vorbereitung.
- Bestätigen Sie immer die Dichte und Lebensfähigkeit der H. pylori-Zellen, indem Sie unmittelbar nach dem Sondensondenverfahren eine lebensfähige Zählung der Inokula durchführen (siehe unten). Bei H. felis ist dies nicht immer möglich, da er auf Kulturmedien in der Regel keine isolierten Kolonien bildet. Die Anzahl lebensfähiger Helicobacters in Inokula kann nicht allein durch optische Dichtemessung (A600) bestimmt werden, da bei dieser Methode nicht zwischen lebensfähigen (d.h. bazillären/spiralförmigen/helikalen) und nicht lebensfähigen (d.h. kokkoidischen) Bakterien unterschieden wird.
- Verwenden Sie optische Dichtewerte, um die Anzahl lebensfähiger H. pylori-Bakterien in Inokula zu schätzen, aber in diesem Fall ist es zunächst notwendig, eine Wachstumskurve zu erstellen. Zu diesem Zweck werden die A600-Werte von H. pylori-Kulturen über die Zeit überwacht und direkt mit den durch Plattenzählung ermittelten Anzahl lebensfähiger Bakterien korreliert.
Anmerkung: Ein geeignetes Verfahren zur Durchführung solcher Wachstumskurvenbestimmungen ist die Kultivierung von Bakterien in einem flüssigen Medium (Abschnitt 1.2) unter Verwendung von Standard-Gewebekulturflaschen mit flachem Boden, die in einem 10%igen CO2 -Inkubator platziert werden. Die Anzahl der KBE, bestimmt aus Aliquoten der Kulturen, die alle 4–6 h über 2–3 Tage gewonnen werden, wird dann mit den entsprechenden A600-Werten verglichen. Wichtig ist, dass für jeden H. pylori-Stamm Wachstumskurven erstellt werden, da diese unterschiedlich schnell wachsen können und darüber hinaus nicht alle Stämme bei 10 % CO2 gut wachsen.
>2. Intragastrische Sonde von Mäusen mit Helicobacter
HINWEIS: Diese Methode der intragastrischen Sonde kann auf andere Bakterienarten angewendet werden, die den Darm besiedeln, z.B. S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.
- Verwenden Sie 6–8 Wochen alte, spezifisch pathogenfreie (SPF) und Helicobacter-freie männliche oder weibliche Mäuse. Verwendung von Tieren mit einem genetischen Hintergrund von C57BL/6 für Infektionsversuche mit H. pylori oder H. felis. In der vorliegenden Studie verwendeten wir Wildtyp- (WT) und genetisch veränderte C57BL/6-Mäuse, denen ein wichtiger angeborener Immunrezeptor fehlte (sogenannte Knock-out- oder KO-Tiere).
Anmerkung: Mäuse mit anderen genetischen Hintergründen können ebenfalls für Helicobacter-Infektionen verwendet werden, jedoch können der Besiedlungsgrad und die Schwere der Erkrankung durch die Art des Wirtshintergrunds beeinflusst werden.
- Aspirieren Sie das bakterielle Inokulum (Schritt 1.5) in 1-ml-Einwegspritzen und ersetzen Sie die mitgelieferten Nadeln durch 23-Gauge-Nadeln, auf denen Einwegkatheter aus Polyethylen (Länge 6–8 cm; Innendurchmesser 0,58 mm) angebracht sind. Befestigen Sie die Katheter an den Nadeln, indem Sie kleine Streifen Kunststofffolie aufbringen (siehe Materialtabelle). Alternativ können Sie die Nadel-Katheter-Einheit durch sterile Kunststoff-Ernährungssonden (20 Gauge x 38 mm) ersetzen.
- Fesseln Sie Mäuse mit einem festen Griff an Hals und Schwanz.
Anmerkung: Dieses Verfahren kann ohne Anästhesie oder alternativ mit einem Inhalationsanästhetikum wie Methoxyfluran oder Isofluran durchgeführt werden.
- Führen Sie den Katheter in die Mitte des offenen Kiefers ein und führen Sie ihn in kaudaler Richtung in Richtung Speiseröhre. Strecken Sie den Hals der Maus aus, um einen einfachen Zugang zum Magen durch die Speiseröhre (und weg von der Luftröhre) zu ermöglichen, bis der größte Teil oder der gesamte Katheter nicht mehr sichtbar ist und ein Widerstand zu spüren ist, der der Magenbasis entspricht. Geben Sie ein spezifisches Aliquot ab, in der Regel 100 μl pro Inokulation (Abbildung 1).
Anmerkung: Mäuse sollten mit ≥ 105 KBE versorgt werden, um eine optimale Besiedlung und Krankheitspathologie zu gewährleisten.
