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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. SPIO-MtbsAb Synthese
- Synthese von SPIO-konjugiertem 2,2'-(ethylendioxy)bisethylamin (EDBE) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden.
- Synthese von SPIO-EDBE-Bernsteinsäureanhydrid (SA).
- Eine alkalische Lösung (5 M NaOH; 10 mL)) aus SPIO-EDBE und SA (1 g; 10 μmol) wird 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt.
- Dialysieren Sie die Lösung mit 20 Wechseln von 2 l destilliertem Wasser unter Verwendung eines molekularen porösen Membranschlauchs (12.000-14.000 MW Cutoff), 6 h für jeden Wechsel.
- Fügen Sie schließlich 100 μl SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml Fe) zu 400 μl 4,5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis-Oberflächenantikörper (MtbsAb) hinzu, um SPIO-MtbsAb unter Verwendung von 1-Hydroxybenzotriazol und (Benzotriazol-1-yloxy) Tripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat als Katalysatoren zu synthetisieren, und rühren Sie die Lösung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur.
- Trennen Sie abschließend die Lösungen durch Gelfiltrationschromatographie vom ungebundenen Antikörper.
- Laden Sie das Reaktionsgemisch (5 ml) auf eine 2,5 cm × 33 cm Säule und eluieren Sie es mit einem phosphatgepufferten Kochsalzpuffer (PBS). Bestätigen Sie den Ab-Nanopartikel-Komplex (d. h. die Nanosonde) mit einem Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit.
>2. Beobachtung der Partikelmorphologie und Messung der Relaxationsstufe
- Untersuchen Sie die durchschnittliche Partikelgröße, Morphologie und Größenverteilung mit einem Transmissionselektronenmikroskop bei einer Spannung von 100 kV.
- Gießen Sie die Komposit-Dispersion auf ein 200-Mesh-Kupfergitter und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft, bevor Sie sie auf das Mikroskop laden.
- Messen Sie die Relaxationszeitwerte (T1 und T2) der Nanosonden mit dem NMR-Relaxometer bei 20 MHz und 37,0 °C ± 0,1 °C.
- Kalibrieren Sie das Relaxometer vor jeder Messung.
- Notieren Sie die r 1- und r2-Werte aus den acht Datenpunkten, die durch die Inversionswiederherstellung bzw. die Carr-Purcell-Meiboom-Gill-Pulssequenz erzeugt wurden, um die Relaxivitäten r1 und r2 zu bestimmen.
>3. Zell-Bildgebung
- Kultivieren Sie humane Monozyten THP-1 in RPMI 1640 mit 10 % fötalem Rinderserum, 50 μg/ml Gentamycinsulfat, 100 Einheiten/ml Penicillin G-Natrium, 100 μg Streptomycinsulfat und 0,25 μg/ml Fungizone in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 37 °C.
- Inkubieren Sie SPIO-MtbsAb-Nanosonden (2 mM) mit 106 koloniebildenden Einheiten (KBE) von Mycobacterium bovis BCG, vorinkubiert mit 1 × 10 7 aktivierten Monozyten in Mikrozentrifugenröhrchen (1 ml) in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C für 1 h.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 x g und entsorgen Sie den Überstand. Lösen Sie die Pellets im Medium (200 μL) wieder auf.
- Scannen Sie die Proben mit einer schnellen Gradienten-Echo-Pulssequenz (Wiederholzeit (TR) = 500; Echozeit (TE) = 20; Flip-Winkel = 10°) durch 3,0-T-MRT zur Bestimmung der Spezifität und Empfindlichkeit der Nanosonde.
>4. BCG (Bacillus Calmette–Guérin) Impfung
- Rekonstituieren Sie den lyophilisierten Impfstoff oder die bakterielle Brühe in Sautons Medium und verdünnen Sie dann die Brühe mit Kochsalzlösung, bis sie wie zuvor beschrieben richtig dispergiert ist.
- Inokulieren Sie einen abgeschwächten lebenden Stamm von M. bovis BCG, der von ADIMMUNE (Taipeh, Taiwan) (Connaught-Stamm; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) mit einem Volumen von 0,1 ml/Maus (d. h. 107 KBE) intradermal in die linke oder rechte dorsale Schulterblatthaut von Mäusen, wie zuvor beschrieben. Injizieren Sie Mäusen Kochsalzlösung als Negativkontrolle. Überwachen Sie die Tiere täglich nach der BCG-Impfung.
- Tiere 1 Monat nach der Bakterienimpfung mit Kohlendioxid-Euthanasie töten. Entnehmen Sie das Gewebe an der intradermalen Impfstelle. Fixieren Sie das Gewebe in 10% Formalin und betten Sie es für Serienschnitte bei 5-10 μm in Paraffin ein. Färben Sie Gewebeschnitte mit den Hämatoxylin/Eosin- und Ziehl-Neelsen-Färbungen für säurefeste Bakterien und mit Berlinblau für Eisen(III)-Eisen.
>5. In-vivo-MRT
- Injizieren Sie Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12 mg/kg Körpergewicht) subkutan in Mäuse zur Tieranästhesie.
- SPIO-TbsAb-Sonden (2 nmol/200 μl) werden in die Schwanzvenen von Mäusen injiziert. MRT-Bild-Mäuse vor und unmittelbar nach der Sondeninjektion und dann alle 5 Minuten für 30 Minuten, um T2-gewichtete schnelle Spin-Echo-Bilder aufzunehmen (TR = 3000; TE = 90; Sichtfeld = 8).
- Quantitative Analyse aller MRT-Bilder mit Hilfe der Signalintensität (SI), einer Messung definierter Regionen von Interesse an vergleichbaren Stellen eines Mtb-Granulomzentrums und des Rückenmuskels, der an einen granulomatösen Bereich angrenzt.
- Berechnen Sie die relativen Signalverstärkungen mit der SI-Messung vor (SIpre; Steuerung) und 0-3 h nach (SIpost) Injektion der Kontrastmittel mit der Formel
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
wobei SIpre das SI der Läsion auf dem präverstärkten Scan und SIpost das SI der Läsion auf dem postverstärkten Scan ist.