Antikörperproduktion aus einer Batch-Überwucherungskultur von transfizierten Säugetierzellen

Zusammenfassung

Quelle: Elgundi, Z. et al., Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers im Labormaßstab.J. Vis. Exp.(2017)

Das Video demonstriert eine Methode zur Herstellung therapeutischer Antikörper unter Verwendung stabil transfizierter Säugetierzellen. Eine Trypton-Supplementierung stimuliert die Zellteilung, was zu Überwucherung führt und eine höhere Antikörperausbeute unterstützt. Das antikörperhaltige Medium wird geerntet, filtriert und für die weitere Verwendung gelagert.

Protokoll

HINWEIS: Für dieses Protokoll muss ein geeigneter Säugetier-Expressionsvektor verwendet werden. Hier wird ein einzelnes Konstrukt verwendet, das zwei Expressionskassetten enthält (d.h. die Expression schwerer und leichter Ketten wird von separaten Promotoren gesteuert). Trastuzumab schwere und leichte Ketten wurden zuvor in den Vektor kloniert. Dieser Vektor war ein Geschenk von Andrew Beavil, das er über ein gemeinnütziges Plasmid-Repositorium erhalten hatte.

>1. Rückgewinnung und Scale-up von Vektor-DNA

HINWEIS: Die Vektor-DNA wurde als weiche Agar-Stichkultur im Stamm Escherichia coli XL-1 Blue aufgenommen; der Vektor trägt Hygromycin-Resistenz.

1. Führen Sie einen sterilen Impfstab oder eine sterile Impfschlaufe in den weichen Agar der Stabkultur ein und streichen Sie dann eine mit 75 μg/ml Hygromycin für isolierte Kolonien vorbereitete Luria Bertani (LB) Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 18-24 Stunden.
2. Eine einzelne Kolonie wird in 5 ml Terrific Bouillon (TB) mit 75 μg/ml Hygromycin geimpft. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C für 18-24 Stunden und schütteln Sie sie bei 225 U/min.
3. Verwenden Sie die Übernachtkultur, um einen Glycerinbestand an Vektor-DNA herzustellen, indem Sie 800 μl Kultur vorsichtig mit 200 μl 80 % Glycerin in einem Kryofläschchen mischen und bei -80 °C einfrieren.
   1. 100 μl der Übernachtkultur zu 100 ml TB mit 75 μg/ml Hygromycin in einem Schüttelkolben mit Stoßdämpfer geben (d. h. 1/1.000 Verdünnung). Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C für 18-24 Stunden mit 225 U/min Schütteln.
4. Nach der Übernachtkultur die Desoxyribose-Nukleinsäure (DNA) gemäß den Herstellerangaben für das Midi/Maxi-Vorbereitungskit extrahieren und reinigen, mit der folgenden Ausnahme: Während des letzten Schritts die DNA mit Wasser (pH 7,0-8,5) eluieren oder resuspendieren.
5. Überprüfen Sie die Konzentration und Reinheit der DNA durch Absorptionsmessungen bei 260 und 280 nm und lagern Sie die DNA dann bei -20 °C.
   HINWEIS: Optional (dringend empfohlen): DNA-Sequenzierung mit vektorspezifischen Primern zur Bestätigung der Identität.

>2. Stabile Transfektion von HEK-293-Zellen

1. Züchtung und Pflege von HEK-293-Zellen (Suspensionszellen) gemäß Standardprotokollen in serumfreien Medien, die mit 0,1 % nichtionischem Tensid in Erlenmeyerkolben ergänzt werden. Halten Sie bei 2 x 10⁵ Zellen/ml und Subkultur jeden vierten Tag. Kultivieren Sie Zellen bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid (CO₂) und 120 U/min Rotation.
   HINWEIS: Die Zellen sollten vor der Transfektion nicht weniger als 4 Tage und nicht länger als 4 Wochen in Kultur gewesen sein. Auch HEK-293-Zellen, die als Monolayer in serumhaltigen Medien gezüchtet wurden, können für dieses Verfahren verwendet werden.
2. Am Tag vor der Transfektion HEK-293-Zellen in einer Menge von 3 x 10⁵ Zellen/ml in Vertiefungen einer 12-Well-Platte in 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), aussäen. Überprüfen Sie am Tag der Transfektion, ob die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreicht haben
3. DNA und Polyethylenimin (PEI) getrennt im Transfektionsmedium verdünnen und anschließend miteinander vermischen.
   1. Verdünnen Sie 1,25 μg Vektor-DNA pro Vertiefung (15 μg für 12 Vertiefungen) in 300 μl Transfektionsmedium. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. 2,5 μl 1 mg/ml PEI-Lösung (30 μl für 12 Vertiefungen, d. h. 1:2 Verhältnis von DNA zu PEI) in 300 μl Transfektionsmedium verdünnen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Verdünnte DNA zu verdünntem PEI geben, vorsichtig mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Geben Sie 50 μl DNA/PEI-Gemisch tropfenweise in jede Vertiefung der Platte. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Transfektionsmischung zu verteilen, und stellen Sie die Platte dann 24 Stunden lang auf 37 °C, 5 % CO₂ auf.
5. Fügen Sie 50 μg/ml Hygromycin B pro Vertiefung hinzu und stellen Sie die Platte 10 Tage lang auf 37 °C, 5 % CO₂ zurück.
   HINWEIS: An Tag 10 sind nicht transfizierte Zellen abgestorben und haben sich von der Oberfläche der Platte gelöst, während stabil transfizierte Zellen lebensfähig und an die Platte gebunden sind.
6. Ersetzen Sie das Medium in den Vertiefungen durch 1/4 Volumen serumfreies Medium und 3/4 Volumen DMEM, ergänzt mit 10 % FBS (d. h. 0,5 ml serumfreies Medium + 1,5 ml DMEM = 7,5 % endgültige Serumkonzentration) und inkubieren Sie es für 4 Tage.
7. Ersetzen Sie das Medium in den Vertiefungen durch 1/2 Volumen serumfreies Medium und 1/2 Volumen DMEM, ergänzt mit 10 % FBS (d. h. 1 ml serumfreies Medium + 1 ml DMEM = 5 % endgültige Serumkonzentration) und inkubieren Sie es 4 Tage lang.
8. Ersetzen Sie das Medium in den Vertiefungen durch 3/4 Volumen serumfreies Medium und 1/4 Volumen DMEM, ergänzt mit 10 % FBS (d. h. 1,5 ml serumfreies Medium + 0,5 ml DMEM = 2,5 % endgültige Serumkonzentration) und inkubieren Sie es 4 Tage lang.
9. Ersetzen Sie das Medium in den Vertiefungen durch 2 ml serumfreies Medium, das mit 0,1 % nichtionischem Tensid (d. h. 0 % der endgültigen Serumkonzentration) ergänzt wird, und inkubieren Sie es 4 Tage lang.
   HINWEIS: Halten Sie während der serumfreien Anpassung einen selektiven Hygromycin-B-Selektionsdruck von 50 μg/ml auf die Zellen aufrecht. Zellen, die an serumfreie Medien angepasst sind, lösen sich von der Oberfläche der Vertiefungen und können sich in Suspension ansammeln. Siehe Schritt 2.1 für Kulturbedingungen mit der zusätzlichen Zugabe von 50 μg/ml Hygromycin B.
10. Mischen Sie die Suspensionskulturen in der 12-Well-Platte vorsichtig mit einer Pipette und geben Sie die Poolzellen in ein separates Röhrchen.
    1. Mit einem Hämozytometer werden gepoolte Zellen und Samen in 30 ml serumfreien Medien in einem Erlenmeyerkolben bei 2 x 10⁵ Zellen/ml gezählt. Kultivieren Sie Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ und 120 U/min Umdrehung. Subkultur und expandieren Sie jeden vierten Tag.
11. Erweitern Sie die Kulturgröße weiter auf die erforderliche Zelldichte, um 10 Fläschchen zu 1 x 10 7 Zellen/Fläschchen für die Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff zu erhalten. Frieren Sie die Zellen in serumfreien Medien ein, die 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthalten.
    HINWEIS: Konditionierte Medien, die Antikörper enthalten, können in jeder Subkultur geerntet werden, um die Proteinproduktion zu bestätigen, oder zur Optimierung der Reinigungsbedingungen verwendet werden. Um konditionierte Medien zu ernten und Zellen für die Subkultur zu erhalten, zentrifugieren Sie die Kultur 5 Minuten lang bei 300 x g und sterilisieren Sie den Überstand dann durch einen 0,22-μm-Filter. Der gefilterte Überstand kann 1-2 Wochen lang bei 4 °C oder für eine längerfristige Lagerung bei -20 °C aufbewahrt werden.

>3. Großflächige Antikörperproduktion aus Batch-Overgrow-Kultur

HINWEIS: Die Antikörperproduktion kann ab Schritt 2.11 nachverfolgt werden, wobei vorhandene Zellen auf die erforderliche Zelldichte expandiert werden, basierend auf dem einzurichtenden Batch-Overgrow-Kulturvolumen. Andernfalls beginnen Zellen, die aus der Kryokonservierung aufgetaut wurden, in diesem Stadium, sobald sie auf eine geeignete Zelldichte und ein angemessenes Zellvolumen expandiert wurden. Verschiedene Kulturzusätze können verwendet werden, um die Antikörperproduktion zu optimieren; Die Verwendung von Trypton zur Erhöhung der Antikörperausbeute wird in diesem Protokoll demonstriert.

1. Samenzellen zu 2 x 10⁵ Zellen/ml in 100 ml serumfreien Medien in zwei Erlenmeyerkolben (zum Vergleich der Antikörperausbeuten aus nicht supplementierten und nährstoffergänzten Kulturen). Kultur bei 37 °C, 5 % CO₂ und 120 U/min.
2. Nach 24 Stunden geben Sie Trypton in einer Endkonzentration von 0,5 % in die nährstoffergänzte Kultur. Gleichen Sie das Volumen der nicht supplementierten Kultur mit serumfreien Medien aus.
3. Führen Sie ab dem 8. Tag täglich Zellzählungen der Kulturen mit einem Hämozytometer durch, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen. Ernten Sie die Kulturüberstände, sobald die Zellviabilität weniger als 80 % beträgt.
   1. Überstand durch Zentrifugation der Kulturen bei 3.000 x g für 15 min ernten, dann den Überstand (mit Antikörper) durch einen 0,22 μm Filter filtrieren. Die Überstände bei 4 °C (kurzzeitig) lagern oder bei -20 °C (langfristig) einfrieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
pFUSE Vektor-Serie	N/A	InvivoGen	Schwere und leichte Antikörpergene, die in getrennten Vektoren exprimiert werden und eine Co-Transfektion erfordern.
mAbXpress Vektor-Serie	N/A	ACYTE Biotech Pty Ltd.	Schwere und leichte Antikörpergene, die in getrennten Vektoren exprimiert werden und eine Co-Transfektion erfordern. Siehe: Jones, M. L. et al. Eine Methode zur schnellen, ligationsunabhängigen Reformatierung von rekombinanten monoklonalen Antikörpern. J Immunol-Methoden. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1-Vektor	N/A	N/A	Schwere und leichte Antikörpergene werden jeweils von einem separaten Promotor in einem einzigen Vektor angetrieben. Siehe: Dodev, T. S. et al. Ein Toolkit für die schnelle Klonierung und Expression rekombinanter Antikörper. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS Vektor-Serie	N/A	Lonza	Multi-cistronischer Vektor mit schweren und leichten Antikörpergenen, die als einzelnes Transkript koexprimiert und translatiert werden.
Multi-cistronic Vektor Serie 1	N/A	N/A	Multi-cistronischer Vektor mit schweren und leichten Antikörpergenen, die als einzelnes Transkript koexprimiert und translatiert werden. Siehe: Li, J. et al. Eine vergleichende Studie verschiedener Vektordesigns für die Expression von rekombinanten IgG-Antikörpern bei Säugetieren. J Immunol-Methoden. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic Vektor Serie 2	N/A	N/A	Multi-cistronischer Vektor mit schweren und leichten Antikörpergenen, die als einzelnes Transkript koexprimiert und translatiert werden. Siehe: Ho, S. C. et al. IRES-vermittelte Tricistronic-Vektoren zur Verbesserung der Generierung von hochmonoklonalen Antikörpern, die CHO-Zelllinien exprimieren. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Artikel-Nr.: 61883	Addgene	Säugetier-Expressionsvektor enthält Trastuzumab-Antikörpergene mit Hygromycin-Resistenzgen; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ war ein Geschenk von Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro-Agar	fas-hg-s	Jomar Lebensforschung	Wird zur Herstellung von salzarmem LB-Agar mit 75 μg/ml Hygromycin verwendet.
Schnelle Medien Hygro TB	fas-hg-l	Jomar Lebensforschung	Wird zur Herstellung von salzarmer TB-Bouillon mit 75 μg/ml Hygromycin verwendet.
Glycerin, BioXtra, ≥99%	Nr. G6279	Sigma-Aldrich	Zu 80% mit Wasser zubereiten und autoklavieren. Bei Raumtemperatur lagern.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Bausatz	G221020	Astral Scientific	Plasmid Maxi Prep Kit; Eluieren oder Resuspendieren von DNA in Wasser (pH 7,0-8,5).
FreeStyle 293-F Zellen	Nr. R790-07	Lebenstechnologien	HEK-293-Zelllinie, die für die Suspensionskultur in serumfreien Medien geeignet ist.
FreeStyle 293 Ausdruck Medium	Artikel-Nr.: 12338-018	Lebenstechnologien	Serumfreie Medien, die speziell für die Aufrechterhaltung der 293-F-Zelllinie und eine hohe Proteinexpression formuliert wurden.
Kolliphor P188	Nr. K4894	Sigma-Aldrich	Nichtionisches Tensid; pluronic F-68; auf 10 % in Wasser vorbereiten und mit einem 0,22-μm-Filter filtrieren. Bei 4 °C lagern.
DMEM, hoher Glukosegehalt	Nr. 11995-065	Lebenstechnologien
Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum	Nr. 10082-147	Lebenstechnologien
Polyethylenimin, linear, MW 25.000	Artikel-Nr.: 23966	Polysciences, Inc.	Bereiten Sie auf 1 mg/ml in Wasser vor. Mit 1 M HCl auf pH 7,0 einstellen (Lösung wird klar) und mit 0,22 μm Filter filtrieren. Bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
OptiPro SFM	Tel.: 12309-050	Lebenstechnologien	Transfektion formulierte serumfreie Medien
Hygromycin B Lösung	ant-hg-1	Jomar Lebensforschung
Dimethylsulfoxid (DMSO)	AJA2225	Thermo Fisher Scientific
Trypton (Kasein, Pepton)	LP0042B	Thermo Fisher Scientific	Bereiten Sie auf 20 % PBS vor und sterilisieren Sie sie mit einem 0,22-μm-Filter. Bei 4 °C lagern.
BLItz-System	45-5000	fortéBIO	Instrument für Messungen der Bioschichtinterferometrie (BLI).

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