Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Sammlung von frischen Kotpellets
- Bereiten Sie sterile Papiertücher, eine stumpfe Pinzette und konische 50-ml-Röhrchen vor.
- Legen Sie einige Papiertücher und Pinzetten in separate Autoklavenbeutel und autoklavieren Sie diese bei 180 °C in trockener Hitze für 30 min. Verwenden Sie auch sterile konische Röhrchen. Wiegen Sie die konischen Rohre und notieren Sie ihr Gewicht auf den Rohren.
- Schalten Sie die Biosicherheitswerkbank im Tierraum ein.
- Nehmen Sie einen autoklavierten, sauberen Mäusekäfig ohne Einstreu und legen Sie ihn in die Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie die Abdeckung und den Futterkorb und stellen Sie sie in den Schrank.
- Lege einige sterile Papiertücher auf den Boden des Käfigs und lege das Metallgestell wieder auf den Käfig.
- Identifizieren Sie altersgerechte Kotspender und legen Sie den Mauskäfig in die Biosicherheitswerkbank. Öffnen Sie den Käfig und fassen Sie vorsichtig eine Spendermaus (C57BL/6J) am Schwanz und legen Sie sie auf das Metallgestell oben auf dem sauberen Käfig.
- Setzen Sie die Käfigabdeckung auf das Gestell und warten Sie, bis das/die Tier(e) Kot abgesetzt haben.
HINWEIS: Legen Sie ein paar Maus-Wurfgeschwister gleichzeitig auf das Gestell.
- Sammeln Sie die Kotpellets und geben Sie sie in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen. Bündeln Sie die Pellets nach Geschlecht. Mischen Sie keine Kotpellets, die von Männchen und Weibchen gesammelt wurden.
- Wiegen Sie das Rohr erneut und berechnen Sie das Gewicht der Kotpellets.
>2. Herstellung der Stuhlsuspension
- Bereiten Sie eine sterile Lösung vor (10% Glycerin in normaler Kochsalzlösung).
- Für jedes Gramm Kotpellets werden 10 ml 10 % Glycerin/normale Kochsalzlösung in das konische Röhrchen gegeben.
HINWEIS: Erhöhen Sie das Lösungsvolumen bei Bedarf auf 20 ml. In dieser Studie wurde ebenfalls 1 ml Lösung für jedes Pellet (5-10 mg) verwendet.
- Homogenisieren Sie die Mischung bei niedriger Geschwindigkeit mit einem Tischhomogenisator oder einem Mischer in einem Abzug, um den Kot wieder aufzuwirbeln (3 x 30 s).
- Die Stuhlsuspension durch 2 Schichten sterile Baumwollgaze (10,2 cm x 10,2 cm) filtrieren. Lagern Sie das Filtrat vorübergehend bis zu 6 h im Kühlschrank oder verpacken Sie es in sterile Kryofläschchen und lagern Sie es in einem -80 °C Gefrierschrank.
- Reinigen Sie den Homogenisator oder Mixer gründlich nach einem Standardverfahren.
>3. Verabreichung von Stuhlsuspension durch orale Sonde
- Tauen Sie die gefrorene Stuhlsuspension auf Eis auf, wenn Sie gefrorene Proben verwenden. Mischen Sie die aufgetaute Stuhlsuspension durch Vortexen.
- Übertragen Sie die frische oder aufgetaute Stuhlsuspension auf 1-ml-Spritzen.
HINWEIS: Jede Maus erhält insgesamt 200 μl Stuhlsuspension, und jede IL-10-/- Maus in der Kontrollgruppe erhält 200 μl 10% Glycerin/normale Kochsalzlösung.
- Wiegen Sie die Mäuse und wählen Sie die richtige Größe der Sondennadel und das maximale Dosierungsvolumen.
HINWEIS: Verwenden Sie für Mäuse mit einem Körpergewicht zwischen 20 und 25 Gramm eine 20 G 3,81 cm gebogene Sondennadel mit einer 2,25 mm Kugel. Weitere Informationen finden Sie gavageneedle.com.
- Testen Sie die Sondennadel, indem Sie die Länge von der Nasenspitze der Maus bis zum Xiphoid-Prozess (Unterseite des Brustbeins) messen. Füllen Sie die Spritze mit 10 % Glycerin/Kochsalzlösung oder Stuhlsuspension und entfernen Sie die Luftblasen in der Spritze und der Nadel.
HINWEIS: Wenn die Nadel länger als die Länge ist, setzen Sie eine Markierung auf den Nadelschaft/Schlauch auf Höhe der Nase. Führen Sie die Nadel/den Schlauch nicht über diesen Punkt hinaus durch das Tier, um eine Magenperforation zu vermeiden.
- Stellen Sie einen Mäusekäfig in die Biosicherheitswerkstatt, entfernen Sie die Kunststoffkäfigabdeckung und lassen Sie das Metallgestell an Ort und Stelle.
- Fassen Sie eine Maus am Schwanz und legen Sie sie auf das Metallgestell. Halten Sie die Maus mit einer Hand am Schwanz und halten Sie das Tier mit Daumen und Mittelfinger der anderen Hand fest, indem Sie die Haut über die Schultern greifen. Auf diese Weise werden die Vorderbeine zur Seite ausgestreckt, was verhindert, dass die Vorderfüße die Nadel herausdrücken. Strecken Sie den Kopf des Tieres vorsichtig nach hinten und halten Sie den Kopf mit einer Hand fest.
HINWEIS: Üben Sie die Handhabung der Maus, bis der Experimentator volles Vertrauen hat, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.
- Platzieren Sie die Sondennadel auf der Zunge im Mund. Schieben Sie sich sanft entlang des oberen Gaumens, bis die Nadel die Speiseröhre erreicht. Führen Sie die Nadel in einer Bewegung sanft durch. Üben Sie keine Gewalt gegen die Nadel aus, wenn ein Widerstand zu spüren ist. Nehmen Sie die Nadel heraus und versuchen Sie es erneut.
- Sobald die Nadel richtig platziert und überprüft ist, verabreichen Sie das Material langsam, indem Sie die an der Nadel befestigte Spritze drücken. Drehen Sie die Nadel nicht und schieben Sie die Nadel nicht nach vorne, da dies die Speiseröhre reißen kann. Ziehen Sie nach der Dosierung die Nadel vorsichtig heraus.
- Bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück. Überwachen Sie das Tier 5-10 Minuten lang, indem Sie nach Anzeichen von Atemnot oder Stress suchen. Überwachen Sie die Mäuse erneut zwischen 12 und 24 Stunden nach der FMT.
