>1. Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen
- Kultur humaner Fibroblasten in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in 6-Well-Platten.
- Bevor Sie mit der Reprogrammierung von Fibroblasten beginnen, beschichten Sie 6-Wells mit Matrigel und inkubieren Sie mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Bei 80 % Konfluenz das Medium aus den Fibroblastenkulturen entfernen und einmal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
- Fügen Sie ausreichend 0,25% Trypsin-EDTA hinzu, um die gesamte Platte zu bedecken, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 °C.
- Sobald sich die Zellen aus den Vertiefungen gelöst haben, fügen Sie die doppelte Menge an DMEM mit 10 % FBS wie an Trypsin hinzu, um den Trypsinverdau zu löschen. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig auf und ab, um die Zellen aufzubrechen. Zählen Sie die Anzahl der einzelnen Zellen mit einem Hämozytometer.
- Übertragen Sie 7 x 105 Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min.
- Überstand entfernen und Zellpellet in Elektroporationslösung resuspendieren. Elektroporieren Sie die Fibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Zellen werden in 100 μl Elektroporationspuffer resuspendiert und 1 μg von jedem episomalen Vektor hinzugefügt. Elektroporatzellen mit Einstellungen von 1.650 V, 10 ms und 3 Zeitimpulsen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in das Modified Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % FBS und Platte 5 x 104 Zellen pro Well einer 6-Well-Platte. Die Platten werden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Nach 48 Stunden wird das Medium aus den transfizierten Fibroblastenkulturen entfernt und durch mTeSR-Medium ersetzt. Tauschen Sie die Kulturmedien täglich aus, bis die Kolonien der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) zur Isolierung bereit sind. iPS-Kolonien können nach 28-35 Tagen beobachtet werden.
- Wenn sie zur Isolierung bereit ist, schneiden Sie eine iPSC-Kolonie mechanisch ab und säen Sie sie in mTeSR-Medium mit 10 μM Rho-assoziierter Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor (Y-27632) auf eine mit Matrigel beschichtete 6-Well-Platte. Wechseln Sie das Nährmedium täglich.
>2. Neuronale Induktion und Aufrechterhaltung menschlicher NPCs
- Wenn iPS-Kulturen eine Konfluenz von etwa 20 % aufweisen, entfernen Sie das mTeSR-Medium und ersetzen Sie es durch ein neuronales Induktionsmedium. Füllen Sie das Medium jeden zweiten Tag auf.
- Entfernen Sie nach 7 Tagen das neuronale Induktionsmedium und ersetzen Sie es durch menschliches NPC-Erhaltungsmedium. Füllen Sie das Medium jeden zweiten Tag bis zu 7 Tage vor dem Passieren der Kulturen auf.
- Vor dem Passieren von Kulturen sind die Platten/Kolben mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit Matrigel zu beschichten.
- Entfernen Sie das Medium aus konfluenten menschlichen NPC-Kulturen und waschen Sie es einmal mit 1x PBS, dann aspirieren Sie PBS aus.
- Fügen Sie so viel Zellablösungslösung hinzu, dass alle Vertiefungen bedeckt sind, und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei 37 °C.
- Stellen Sie sicher, dass sich alle Zellen gelöst haben. Es wird die doppelte Menge DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) wie die Zellablösungslösung in die Vertiefungen/Kolben gegeben.
- DMEM/F-12-haltige Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführen und 5 min bei 200 x g zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml humanem NPC-Erhaltungsmedium. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig auf und ab, um die Zellen aufzubrechen.
- Ein Drittel der Gesamtzellen wird in Matrigel-beschichtete Kulturvertiefungen/-kolben gefüllt und ausreichend Medium mit 10 μM Y-27632 nachgefüllt. Kulturgefäße bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Teilen Sie die Kulturen alle 3 bis 4 Tage 1:3 und füllen Sie das Medium jeden zweiten Tag auf. Halten Sie menschliche NPC-Kulturen in hoher Dichte, um eine Differenzierung zu verhindern.
>3. Differenzierung von menschlichen NPCs in Neuronen in Kokulturen
- Fügen Sie den lentiviralen Vektor Synapsin1-tdTomate zur menschlichen NPC-Kultur hinzu, bevor Sie die Differenzierung in Neuronen initiieren. Bereiten Sie Astrozyten/kortikale Neuronen-Cokulturen einen Tag im Voraus vor, bevor Sie menschliche NPCs differenzieren.
- Waschen Sie humane NPC-Kulturen einmal mit 1x PBS und fügen Sie so viel Zellablösungslösung hinzu, dass alle Vertiefungen/Kolben bedeckt sind, und inkubieren Sie dann 5 Minuten lang bei 37 °C.
- Stellen Sie sicher, dass sich alle Zellen gelöst haben. Es wird die doppelte Menge DMEM/F-12 wie die Zellablösungslösung in die Vertiefungen/Kolben gegeben. In ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen umfüllen. Bei 200 x g 5 min zentrifugieren.
- Überstand entfernen und Zellen in 5 ml neuronalem Differenzierungsmedium resuspendieren. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig auf und ab, um das Zellpellet in einzelne Zellen aufzubrechen. Zählen Sie die Anzahl der einzelnen Zellen mit einem Hämozytometer.
- Aspirieren Sie vorsichtig Medium aus Astrozyten-/kortikalen Neuronenkulturen. Humane NPCs mit 5 x 103 Zellen/cm/cm,2 in 500 μl neuronalem Differenzierungsmedium, ergänzt mit 10 μM Y-27632 für jede 24-Well-Platte, plattieren. Geben Sie vorsichtig Medium mit menschlichen NPCs in jede Vertiefung, um eine Störung der Astrozyten und kortikalen Neuronen zu vermeiden.
- Die Platten werden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums mindestens 28 Tage lang alle zwei bis drei Tage durch frisches Medium.
