Entwicklung eines Dreifachzellkulturmodells der menschlichen Blut-Hirn-Schranke

Zusammenfassung

Quelle: Fattakhov, N., et al. Ein dreifaches primäres Zellkulturmodell der menschlichen Blut-Hirn-Schranke zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls in vitro. J. Vis.(2022)

Dieses Video zeigt die gemeinsame Kultivierung von menschlichen Gehirnperizyten, Astrozyten und Endothelzellen. Jede Zellschicht wird separat gebildet und dann zusammen kultiviert, wodurch ein dreischichtiges System entsteht, das die zelluläre Anordnung der Blut-Hirn-Schranke nachahmt

Protokoll

>1. Einstellung des Dreifachzellkultur-BHB-Modells

1. Aussaat von Perizyten
   1. HBVP (Gefäßperizyten des menschlichen Gehirns) in T75-Kulturkolben mit aktivierter Oberfläche für die Zelladhäsion in einem 5%igen CO₂ -Inkubator bei 37 °C kultivieren, bis sie konfluent sind. Sobald die Konfluenz erreicht ist, aspirieren Sie das alte Perozytenmedium und waschen Sie die Zellen mit 5 ml warmer Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Das DPBS wird aspiriert und die Zellen werden mit einer Kombination aus 4 ml warmer Trypsin-EDTA-Lösung und 1 ml DPBS aus dem Kolben gelöst.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Durchgängen nach P7.
   2. Den Kolben 5 min bei 37 °C in einem CO₂ -Inkubator inkubieren. Betrachten Sie unter einem Mikroskop, um zu bestätigen, ob sich die Zellen vom Kolben gelöst haben. 5 ml warmes Perinozytenmedium (mit 2 % fötalem Rinderserum [FBS]) in den Kolben geben und die abgelösten Zellen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
   3. Die Zellsuspension wird 3 Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert, so dass die Zellen am Boden des Röhrchens ein Pellet bilden. Saugen Sie das Medium aus dem Rohr an und stellen Sie sicher, dass das Zellpellet intakt bleibt.
   4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Perozytenmedium; berechnen Sie die Menge des Mediums in Abhängigkeit von der Konfluenz der Zellen und der Anzahl der benötigten Well-Inserts. Nehmen Sie 10 μl der resuspendierten Zellen, legen Sie sie in einen Zellzählobjektträger und zählen Sie die Anzahl der Zellen.
   5. Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen/Insert in 1 ml Perozytenmedium auf die abluminale Seite der Well-Inserts (6-Well-Format).
      Anmerkung: Bei der Aussaat von HBVP auf der Unterseite von Wendeschneidplatten ist es wichtig, die Einlegeplatten auf den Kopf zu stellen. Während die Platte flach auf eine Oberfläche gelegt wird, entfernen Sie den unteren Teil, um die abluminale Seite der Well-Einsätze freizulegen. Decken Sie die Well-Einsätze mit der umgedrehten Platte ab, nachdem Sie die Perizytenzellsuspension auf die abluminale Seite gegeben haben, um eine Verdunstung zu verhindern. Alle Platten über Nacht in einem 5%igen CO₂ -Inkubator bei 37 °C auf den Kopf stellen.
2. Aussaat von Astrozyten
   1. HA (Humane Astrozyten) in T75-Kolben in einem 5%igen CO₂ -Inkubator bei 37 °C kultivieren, bis die Konfluenz erreicht ist. Befolgen Sie die obigen Schritte 1.1.1-1.1.4 unter Verwendung von Astrozytenmedium (das ebenfalls 2% FBS enthält) anstelle von Peritozytenmedium.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Passagen nach P9.
   2. Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen/Well auf den Boden der 6-Well-Platten der Gewebekultur. Decken Sie die Platte ab, um eine Verdunstung zu verhindern, und bewahren Sie alle Platten über Nacht in einem 5%igen CO₂ -Inkubator bei 37 °C auf.
3. Aussaat von Endothelzellen
   1. Kultivieren Sie HBMEC (Mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Gehirns) in Gewebekulturschalen in einem 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C, bis sie zusammenfließen. Führen Sie die obigen Schritte 1.1.1-1.1.4 aus, indem Sie ein vollständiges klassisches Medium (mit 10 % FBS) anstelle eines Perozytenmediums verwenden.
      Anmerkung: Vermeiden Sie die Verwendung von Passagen nach P12.
   2. Die 6-Well-Platten mit den Astrozyten und die Well-Einsätze (6-Well-Format) mit Perizyten aus dem 5 %_{CO 2} -Inkubator bei 37 °C herausnehmen. Das Astrozytenmedium aus den 6-Well-Platten der Gewebekultur aspirieren. Geben Sie jeweils 1 ml Perozytenmedium und 1 ml Astrozytenmedium in jede Vertiefung.
   3. Aspirieren Sie das Perizozytenmedium aus den Well-Einsätzen und legen Sie es in die 6-Well-Platten der Gewebekultur, die die ausgesäten Astrozyten enthalten. HBMEC mit einer Dichte von 300.000 Zellen/Well in 2 mL des kompletten klassischen Mediums auf die apikale Seite der gleichen Well-Inserts ausseeden.
      Anmerkung: Die Endothelzellen sollten am nächsten Tag auf der apikalen Seite der Well-Inserts ausgesät werden, nachdem die Perizyten auf der abluminalen Seite der Well-Inserts und die Astrozyten auf 6-Well-Platten der Gewebekultur ausgesät wurden. Die Zellen sollten sechs Tage lang in Dreifachkultur gehalten werden, um BHS-ähnliche Eigenschaften zu induzieren. Das Zellkulturmedium sollte in beiden Vertiefungskammern 24 Stunden vor den Experimenten gewechselt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24 mm Transwell mit 0,4 μm Poren-Polyester-Membraneinlage	Corning	Artikel-Nr.: 3450
35 mm Schalen mit Glasboden	MatTek Biowissenschaften (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrozyten Medium	Zelle Wissenschaft	1801
Bindungsfaktor	Zellsysteme (Fisher Scientific)	4Z0-201
Komplettes Classic Medium mit Serum und CultureBoost	4Z0-500	Zell-Systeme
Corning 50 mL PP Zentrifugenröhrchen (konischer Boden mit CentriStar Kappe	VWR	430829
Corning 75cm² U-förmiger abgeschrägter Hals, unbehandelter Zellkulturkolben	Corning	Artikel-Nr.: 431464U
Corning CellBIND 96-Well-Mikrotiterplatten aus schwarzem Polystyrol mit flachem, klarem Boden	Corning	3340
Countes Zellzählkammer Folien	Thermo Fisher Scientific	Nr. C10228
Countess II FL Automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher Scientific	ZGEXSCCOUNTESS2FL
DMEM Medium (keine Glukose, kein Glutamin, kein Phenolrot)	ThermoFisher	Nr. A14430-01	Glukosefreies Medium
DPBS (kein Kalzium, kein Magnesium)	ThermoFisher	14190250
EBM Basalmedium für das Wachstum von Endothelzellen, phenolrotfrei, 500 mL	Lonza	Nr. CC-3129
CO2-Inkubator
Zentrifuge