Calcium-Bildgebung in einzelnen Neuronen zur Regulierung des Eiablageverhaltens bei Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Quelle: Ravi, B. et al., Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Kalzium-Bildgebung in einzelnen Neuronen von sich benehmenden Caenorhabditis elegans unter Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Reporterproteine. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Abbildung der Wurmbewegung und der Messung der Reporterfluoreszenzverhältnisse von Neuronen erforderlich sind, um den intrazellulären Kalziumspiegel mit der neuronalen Aktivität und Verhaltensänderungen während der Eiablage zu korrelieren.

Protokoll

>1. Stämme, Nährmedien und Montage von Tieren

1. C. elegans-Würmer werden bei 20 °C auf standardmäßigen 60-mm-Nematoden-Agarplatten (NGM) gezüchtet, die mit OP50 E. coli-Bakterienfutter besät sind.
2. Bereiten Sie zwei Plasmide für jeden zellspezifischen Promotor von Interesse vor: eines, das die Expression von GCaMP5 zur Aufzeichnung von intrazellulärem Ca²⁺ antreibt, und das zweite, das die Expression von mCherry steuert, um eine ratiometrische Quantifizierung von GCaMP5-Fluoreszenzänderungen zu ermöglichen und die Objektsuche und -messung zu vereinfachen.
   Anmerkung: Die ratiometrische Bildgebung von GCaMP5:mCherry korrigiert Schwankungen in der GCaMP5-Fluoreszenz, die sich aus Änderungen des Fokus und der Tierbewegung ergeben, nicht aus tatsächlichen Veränderungen des intrazellulären Ca²⁺.
3. Injizieren Sie GCaMP5- und mCherry-exprimierende Plasmide zusammen mit dem sichtbaren Rettungsmarker-Plasmid pL15EK in die Gonaden von LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X-Mutanten und gewinnen nicht-Muv lin-15(+)-Tiere, die GCaMP5 und mCherry exprimieren, aus einem Transgen mit hoher Kopie. Verwenden Sie den lite-1-Mutantenhintergrund, um das Verhalten zur Vermeidung von blauem Licht zu reduzieren.
4. Integration von Transgenen in Chromosomen, um Mosaik zu reduzieren und die Erzeugung von zusammengesetzten Mutantenstämmen zu vereinfachen.
   Anmerkung: Der hier beschriebene LX2004-Stamm trägt ein integriertes Transgen mit hoher Kopie, das GCaMP5 und mCherry in den HSNs des nlp-3-Promotors exprimiert (siehe Materialtabelle). Es wurde festgestellt, dass der nlp-3-Promotor eine starke Expression in den HSNs von späten L4- und adulten Tieren auslöst, ohne signifikante Defekte in der HSN-Entwicklung oder im Eiablageverhalten im Vergleich zu anderen getesteten Promotoren (z. B. tph-1, egl-6 und unc-86) zu verursachen. Dieser Stamm und andere, die GCaMP5 und mCherry in den Motoneuronen des Bauchmarks (VC), der Vulvamuskulatur und den uv1-Neuroendokrinen exprimieren, sind vom Caenorhabditis Genetics Center erhältlich, und Details zu ihrer Konstruktion wurden beschrieben.
5. Tragen Sie OP50-Bakterienfutter von einer ausgesäten NGM-Agarplatte auf den Boden eines Platinwurmpickels auf und verwenden Sie es, um ~ 20 späte L4 LX2004-Tiere, die GCaMP5 und mCherry in den HSNs exprimieren, aus dem nlp-3-Promotor zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die sich entwickelnde Vulva im Stereomikroskop als klarer dunkler Fleck erscheint, der von einer weißen Sichel umgeben ist. Die Tiere werden 24-40 Stunden lang bei 20 °C inkubiert.
6. Tragen Sie nach der Inkubation OP50 auf das Pickel auf und übertragen Sie ~ 3 der Würmer auf eine unbesäte NGM-Platte, wobei Sie eine kleine Menge Futter zurücklassen, von dem sich die Würmer während der Bildgebung ernähren können. Sorgen Sie für ausreichend Nahrung, da zu wenig bakterielle Nahrung die Würmer dazu anregt, sich von der Mitte des Tellers zu entfernen, während zu viel Nahrung die Hintergrundfluoreszenz erhöht und Hypoxie verursacht.
7. Schneiden Sie mit einem flachen, abgerundeten Spachtel ein ~ 20 mm x 20 mm großes Stück aus der Platte mit den Würmern ab und legen Sie das Stück mit der Vorderseite nach unten auf die Mitte eines sauberen Deckglases von 24 mm x 60 mm #1,5 (Abbildung 1). Starten Sie die Anwendung von einer Seite, um zu verhindern, dass Blasen unter dem Deckglas eingeschlossen werden und die Bildgebung beeinträchtigen. Bringen Sie ein Deckglas von 22 mm x 22 mm #1 auf die Oberseite des Brockens an, um das Anhaften und Verdunsten zu reduzieren.

>2. Einrichtung von Hardware und Instrumentierung

1. Platzieren Sie die inszenierten, transgenen Würmer auf dem Tisch eines inversen Mikroskops mit einem Plan-Apochromat 20x Objektiv mit ≥ numerischer Apertur und 0,7, einem motorisierten XY-Tisch, der mit einem Joystick gesteuert werden kann, einem Bildsplitter und Fluoreszenzfiltern für gleichzeitige GCaMP5- und mCherry-Anregung und -Emission, Kameras für Fluoreszenz- und Infrarot-Hellfeldbildgebung sowie einem triggerbaren Leuchtdiodenbeleuchtungssystem (LED) (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Ein 80/20-Strahlteiler sendet 80 % des Bildsignals an die Fluoreszenzkamera und 20 % an die Hellfeldkamera. Es kann auch ein aufrechtes Mikroskop verwendet werden, aber der NGM-Brocken sollte in diesem Fall zwischen einem Objektträger und dem großen Deckglas platziert werden.
   1. Verwenden Sie die binokularen Okulare, um einen Wurm für die Bildgebung auszuwählen. Wenn ein Tier ausgewählt ist, schieben Sie den Infrarotfilter über den Kondensator.
2. Transistor-Transistor-Logik-Trigger (TTL)
   1. Schließen Sie Koaxialkabel von jeder der drei TTL-Trigger-Ausgangsleitungen an der Fluoreszenzkamera an. Verbinden Sie den ersten Ausgang mit dem BNC-Eingang #3 des LED-Beleuchtungssystems.
   2. Verbinden Sie den zweiten Ausgang mit einem BNC-Bananenadapter mit grünen und braunen Drähten vom 8-poligen GPIO-Stecker, der zum GPIO-Eingang #3 (Pin 4) bzw. zur Masse (Pin 5) der Infrarotkamera führt.
   3. Verbinden Sie den dritten Ausgang mit einem BNC-Bananenadapter mit Überbrückungsdrähten, die zum digitalen Eingang #8 und zur Masse im digitalen Erfassungsgerät führen (Abbildung 2B).
3. Digitales Erfassungsgerät (DAQ)
   1. Verbinden Sie die DAQ-Mikrocontroller-Karte (siehe Materialtabelle) über ein USB-Kabel mit dem PC. Aktualisieren Sie die Firmware mit dem Standard-Firmata-Protokoll (siehe Materialtabelle) und konfigurieren Sie den USB-Anschluss für die Kommunikation mit 57600 Baud.
4. Leds
   1. Führen Sie die LED-Controller-Software aus (siehe Materialtabelle). Schalten Sie den Trigger-Modus von "Kontinuierlich" auf "Gated" um und wählen Sie den Trigger-Kanal "3" sowohl für die 470- als auch für die 590-nm-LEDs.
   2. Schalten Sie die LED-Leistung für jede LED ein und geben Sie sie ein (stellen Sie z. B. die 470-nm-LED auf 20 % und die 590-nm-LED auf 40 % ein).
5. Führen Sie das Kommunikationsskript für die serielle Phase 'XY-stage-final' in Bonsai aus (siehe Materialtabelle). Klicken Sie auf den grauen Knoten "CsvWriter" und wählen Sie einen Ordner aus, in dem die aufgezeichneten X- und Y-Stage-Informationen gespeichert werden sollen (Abbildung 3). Drücken Sie die grüne Pfeilspitze in der Symbolleiste, um die Datenerfassung zu initialisieren.
   Anmerkung: Das Skript beginnt mit der Aufzeichnung der X- und Y-Tischposition, wenn die Fluoreszenzkamera ein TTL-Signal sendet. Dieses Skript gibt vier Datenspalten aus: Frame-Nummer, X-Position (μm), Y-Position (μm) und das Intervall zwischen Frames (s).
6. Wählen Sie in der Aufnahmesoftware für Infrarotkameras (siehe Materialtabelle) unter "Benutzerdefinierte Videomodi" die Option "Modus 1" (2 x 2 Binning; 1.024 x 1.024 Pixel) und "Pixel Format Raw 8" aus. Stellen Sie unter "Trigger / Strobe" die Trigger-Eingangsleitung (GPIO) auf "3", die Polarität auf "High" und den "Mode" auf "14". Schalten Sie "Aktivieren" um, um die Frame-Erfassung zu stoppen, bis ein TTL-Triggersignal empfangen wird.
   1. Lassen Sie dieses Fenster geöffnet und klicken Sie auf die rote Schaltfläche "Aufnehmen" in der Symbolleiste der Hauptkameraansicht. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Bildsequenzen gespeichert werden sollen. Wählen Sie den Aufnahmemodus "Gepuffert" und speichern Sie "Bilder" im JPEG-Format. Klicken Sie auf "Aufnahme starten", um die Erfassung zu initialisieren.
7. Fluoreszenzkamera und Bildsplitter
   Anmerkung: GCaMP5- und mCherry-Fluoreszenzkanäle müssen gleichzeitig erfasst werden, um eine korrekte Bildregistrierung für die ratiometrische Quantifizierung zu gewährleisten. Ein Bildsplitter ermöglicht die zweikanalige Erfassung der GCaMP5- und mCherry-Fluoreszenz auf einem Sensor.
   1. Stellen Sie auf der Registerkarte "Capture" der Bildaufnahmesoftware (siehe Materialtabelle) die Belichtungszeit auf 10 ms, das Binning auf 4x und die Bildtiefe auf 16 Bit ein. Wählen Sie ein zentriertes Kamera-Subarray mit einer Breite von 512 Pixeln und einer Höhe von 256 Pixeln aus. Klicken Sie auf "Ausgabe-Trigger-Optionen anzeigen" und setzen Sie alle Trigger auf "Positiv"
      HINWEIS: Die Datenerfassung kann gelegentlich TTL-Trigger verpassen, wenn sie 10 ms oder weniger betragen.
   2. Stellen Sie sicher, dass "Trigger 1" und "Trigger 2" auf "Exposure" eingestellt sind, während "Trigger 3" auf "Programmierbar" mit einer "Periode" von 25 ms eingestellt ist. Wählen Sie auf der Registerkarte "Sequenz" die Option "Zeitraffer" mit einer "Halbzeitverzögerung1" von 50 ms, um Bilder mit 20 Hz aufzunehmen. Wählen Sie "In temporärem Puffer speichern".
8. PMT-Verstärkung und Laserintensität bei konfokaler Dreikanal-Bildgebung
   1. Stellen Sie die PMT-Verstärkung so ein, dass die Hintergrundfluoreszenz auf einem Pegel knapp über dem Minimum (Schwarzwert) liegt. Erhöhen Sie die Laserleistung um 561 nm (grün), bis ein einzelnes gesättigtes 12-Bit- oder 16-Bit-Pixel am präsynaptischen Terminus im mCherry-Kanal beobachtet wird.
   2. Passen Sie die Laserintensität von 488 nm (blau) so an, dass die GCaMP5-Fluoreszenz nur am präsynaptischen Terminus über dem Hintergrund sichtbar ist. Diese niedrige Einstellung verhindert die Sättigung der GCaMP5-Pixel, wenn die Fluoreszenz als Reaktion auf starke Ca2⁺-Transienten zunimmt. Öffnen Sie die konfokale Lochblende vollständig, um den Lichteinfang zu maximieren.

>3. Ratiometric Ca²⁺ Bildgebung und Verhaltensaufzeichnung

1. Klicken Sie auf der Registerkarte "Sequenz" in der Fluoreszenzerfassungssoftware auf "Start", um die Aufnahme zu starten. Verfolgen Sie den Wurm mit dem Joystick und halten Sie die interessierende(n) Zelle(n) und Synapsen scharf und in der Mitte des Sichtfeldes (FOV). Klicken Sie auf die Schaltfläche "Statistiken" im Histogramm-Fenster, um die Pixelstatistiken jedes Kanals anzuzeigen.
2. Passen Sie die LED-Leistung an, um eine maximale Einzelpixel-mCherry-Fluoreszenz am präsynaptischen Terminus von ≥ 8.000 Zählungen (~ 4.000 Photoelektronen) zu gewährleisten, was einen Dynamikbereich von ~ 12 Bit über dem Hintergrund (~ 100 Photoelektronen) ergibt. GCaMP5-Signale am präsynaptischen Terminus während des Ruhezustands (niedrig) Ca²⁺ sollten etwa ~ 2.500 Zählungen betragen - gerade über dem Hintergrund sichtbar.
3. Nehmen Sie auf, bis ein aktiver Zustand der Eiablage erreicht ist; typischerweise geschieht dies bei einem Wildtyp-Wurm alle 20-30 Minuten. Speichern Sie eine Teilmenge von 10 Minuten (12.001 Frames), 6.000 Frames vor und nach dem ersten Eiablageereignis (Frame 6.001). Achten Sie darauf, dass Sie die gleiche Teilmenge der Hellfeldbilder des Wurmverhaltens und der Zeitpunkte der XY-Tischposition beibehalten, da sonst die genaue Synchronisation der Datenströme verloren geht.
4. Verwenden Sie ImageJ und das BioFormats-Plugin (siehe Materialtabelle), um Bildsequenzen in das Image Cytometry Standard (.ics)-Format zu konvertieren, damit sie in die Ratiometric Quantitation-Software importiert werden können.

Ergebnisse

Abbildung 1. C. elegans-Montagetechnik zur hochauflösenden Abbildung der Aktivität und des Verhaltens von eilegenden Schaltkreisen.Oben, die letzte Halterung von der Seite. Unten, die endgültige Halterung, wie sie durch die Unterseite des großen Deckglases gesehen wird. Pfeile zeigen OP50-Bakteriennahrung, C. elegans-Würmer und Eier, die zwischen dem NGM-Agar-Bro...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Wachstum, Kultivierung und Montage von C. elegans
Bakterienstamm Escherichia coli, OP50	Caenorhabditis Genetikzentrum	OP50	Futter für C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biologische Sicherheit Stufe 1
HSN GCaMP5+mKirsch-Wurmstamm	Caenorhabditis Genetikzentrum	LX2004	Integriertes Transgen mit nlp-3-Promotor zur Steuerung der GCaMP5- und mCherry-Expression in HSN. Vollständiger Genotyp: vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
LITE-1(CE314), LIN-15(N765TS) Mutantenstamm für die Transgenpräparation	Verfasser	LX1832	Stamm zur Rückgewinnung von Transgenen mit hoher Kopie nach Mikroinjektion mit pL15EK lin-15(n765ts) Rettungsplasmid. Trägt auch die verknüpfte Lite-1(ce314)-Mutation, die die Empfindlichkeit gegenüber blauem Licht reduziert. Auf Anfrage beim Autor erhältlich
pL15EK lin-15a/b genomisches Rettungsplasmid	Verfasser	pL15EK	Rettungsplasmid zur Rückgewinnung transgener Tiere nach Injektion in LX1832 LITE-1(CE314), LIN-15(N765TS) X Dehnung. Auf Anfrage beim Autor erhältlich
pKMC299 Plasmid	Verfasser	pKMC299	Plasmid für die Expression von mCherry in den HSNs aus dem nlp-3-Promotor. Hat nlp-3 3' unübersetzte Region
pKMC300 Plasmid	Verfasser	pKMC300	Plasmid für die Expression von GCaMP5 in den HSNs aus dem nlp-3-Promotor. Hat nlp-3 3' unübersetzte Region
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma	Nr. P8281	Zur Vorbereitung von NGM-Platten
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma	Nr. P5655	Zur Vorbereitung von NGM-Platten
Magnesiumsulfat-Heptahydrat	Amresco	662	Zur Vorbereitung von NGM-Platten
Calciumchlorid-Dihydrat	Alfa Aesar	Artikel-Nr.: 12312	Zur Vorbereitung von NGM-Platten
Pepton	Becton Dickinson	Artikel-Nr.: 211820	Zur Vorbereitung von NGM-Platten
Natriumchlorid	Amresco	Nr. 241	Zur Vorbereitung von NGM-Platten
Cholesterin	Alfa Aesar	Nr. A11470	Zur Vorbereitung von NGM-Platten
Agar, bakteriologisch Typ A, hochrein	Affymetrix	Artikel-Nr.: 10906	Zur Vorbereitung von NGM-Platten
60 mm Petrischalen	VWR	Tel.: 25384-164	Zur Vorbereitung von NGM-Platten
24 x 60 mm Micro-Cover-Brille, #1,5	VWR	Tel.: 48393-251	Deckglas, durch das Würmer abgebildet werden
22 x 22 mm Micro-Cover-Brille, #1	VWR	Artikel-Nr.: 48366-067	Deckglas, das die Oberseite des Agar-Stücks bedeckt
Stereomikroskop mit Durchlichtbasis	Leica	M50	Präpariermikroskop für die Wartung, Inszenierung und Montage von Wurmstämmen
Platin-Iridiumdraht, (80:20), 0,2 mm	ALFA AESAR	AA39526-BW	Für die Übertragung von Würmern
Mikroskop für Kalzium-Bildgebung
Anti-Vibrations-Lufttisch	TMC (Englisch)	Nr. 63-544	Micro-g' Labortisch 30" x 48" Anti-Vibrationstisch mit 4" CleanTop M6 auf 25mm Platte
Inverses Verbundmikroskop	Zeiss	Artikel-Nr.: 431007-9902-000	Axio Observer.Z1 inverses Mikroskop
Seitenanschluss L80/R100 (3 Positionen)	Zeiss	Artikel-Nr.: 425165-0000-000	Um 20 % der Ausgabe an die Hellfeldkamera (CMOS) und 80 % an die Fluoreszenzkamera (sCMOS) umzuleiten
Kippbarer Beleuchtungsträger	Zeiss	Artikel-Nr.: 423920-0000-000	Für Infrarot-/Verhaltensbildgebung
Lampengehäuse 12V/100W mit Kollektor	Zeiss	Artikel-Nr.: 423000-9901-000	Für Infrarot-/Verhaltensbildgebung
Halogenlampe 12V/100W	Zeiss	Artikel-Nr.: 380059-1660-000	Für Infrarot-/Verhaltensbildgebung. Weißlicht-LEDs emittieren kein signifikantes Infrarotlicht, so dass sie nach dem Infrarot-Bandpassfilter keine Hellfeld-Bildgebung zulassen
32 mm Infrarot-Bandpassfilter (750-790 nm) für Halogenlampe	Zeiss	Artikel-Nr.: 447958-9000-000	BP 750-790; DMR 32mm, für Infrarotbeleuchtung für Hellfeld und Verhalten
Kondensatorrevolver mit 6 Filtern (LD 0,55 H/DIC/Ph), motorisiert	Zeiss	Artikel-Nr.: 424244-0000-000	Für Infrarot-/Verhaltensbildgebung
Kondensor & Shutter	Zeiss	Artikel-Nr.: 423921-0000-000	Für Infrarot-/Verhaltensbildgebung
Binokulares Okular mit Fototubus für Infrarot-CMOS-Kamera	Zeiss	Artikel-Nr.: 425536-0000-000	Für Infrarot-/Verhaltensbildgebung
Okular 10x, 23mm	Zeiss	Artikel-Nr.: 444036-9000-000	Zur Lokalisierung von Würmern auf dem Agar-Brocken
C-Mount Adapter 2/3" 0,63x Vergrößerung	Zeiss	Artikel-Nr.: 426113-0000-000	Halterung für Infrarot-CMOS-Kamera
CMOS-Kamera für Infrarot-Hellfeld und -Verhalten (1"-Sensor)	FLIR (ehemals Point Grey Research)	GS3-U3-41C6NIR-C	Kamera für Hellfeld-Bildgebung
USB 3.0 Host Controller-Karte	FLIR (ehemals Point Grey Research)	Nr. ACC-01-1202	Fresco FL1100, 4 Anschlüsse
8-polig, 1m GPIO-Kabel, Hirose HR25 Rundsteckverbinder	FLIR (ehemals Point Grey Research)	ACC-01-3000	Kabel für TTL-Triggerung. Das grüne Kabel wird mit GPIO3 / Pin 4 und das braune Kabel mit Masse / Pin 5 verbunden
Plan-Apochromat 20x/0,8 WD=0,55 M27	Zeiss	Artikel-Nr.: 420650-9901-000	Beste Kombination aus Vergrößerung, numerischer Apertur und Arbeitsabstand
6-Würfel-Reflektorrevolver, motorisiert	Zeiss	Artikel-Nr.: 424947-0000-000	Für die Fluoreszenzbildgebung
Fluoreszenz-Lichtzug, motorisiert	Zeiss	Artikel-Nr.: 423607-0000-000	Für die Fluoreszenzbildgebung
Fluoreszenz-Shutter	Zeiss	Artikel-Nr.: 423625-0000-000	Für die Fluoreszenzbildgebung
GFP und mCherry Doppelanregungs- und Emissionsfilterwürfel (für Mikroskop)	Zeiss	Artikel-Nr.: 489062-9901-000	FL Filterset 62 HE BFP+GFP+HcRed für die Fluoreszenzbildgebung
LED-Beleuchtungssystem	Zeiss	Artikel-Nr.: 423052-9501-000	Auslösebares Colibri.2 LED-System für Leuchtstofflampen
GFP LED-Modul (470 nm)	Zeiss	Artikel-Nr.: 423052-9052-000	Colibri.2 LED für GFP-Fluoreszenzanregung
mCherry LED-Modul (590 nm)	Zeiss	Artikel-Nr.: 423052-9082-000	Colibri.2 LED für mCherry Fluoreszenzanregung
Blendenstopp-Schieber für Auflichtgeräte	Zeiss	000000-1062-360	Feldblende zur Begrenzung der LED-Beleuchtung auf das Sichtfeld der Kamera
C-Mount Adapter 1" 1,0x	Zeiss	Artikel-Nr.: 426114-0000-000	Adapter für Bildsplitter und sCMOS-Fluoreszenzkamera
Bildsplitter	Hamamatsu	Nr. A12801-01	Gemini W-View, andere Bildsplitter können verwendet werden, aber sie sind möglicherweise nicht für die große Sensorgröße der sCMOS-Kameras optimiert
GFP / mCherry dichroitischer Spiegel (Bildsplitter)	Semrock	DI02-R594-25x36	Aufspaltung von GCaMP5 aus mCherry- und Infrarotsignalen
GFP-Emissionsfilter (Bildsplitter)	Semrock	Artikel-Nr.: FF01-525/30-25	Erfassung der GCaMP5-Fluoreszenz
mCherry/ Emissionsfilter (Bildsplitter)	Semrock	Artikel-Nr.: FF01-647/57-25	Dieser Filter ist notwendig, um das Infrarotlicht auszuschließen, das für die Hellfeldfotografie verwendet wird
sCMOS-Kamera für Fluoreszenz (1"-Sensor)	Hamamatsu	A12802-01 / C11440-22CU	Orca FLASH 4.0 V2. Neuere Modelle ermöglichen separate Bildaufnahmeeinstellungen auf separaten Hälften des Sensors, so dass Zweikanalbilder in Kombination mit einem Bildsplitter aufgenommen werden können
Motorisierter XY-Tisch	Märzhäuser	SCAN IM 130 x 100	Bewegung des Tisches; die XY-Auflösung dieses Tisches beträgt 0,2 μm pro Schritt
XY Stage Controller mit Joystick	LUDL	MAC6000, XY-Joystick	Manuelle Verfolgung von Würmern. MAC6000 Controller sollte über die serielle Schnittstelle (RS-232) mit dem PC verbunden werden, die auf 115200 Baud konfiguriert ist
Digitale Erfassungskarte (DAQ)	Arduino	Vereinte Nationen	Empfangen von TTL-Triggern von der sCMOS-Kamera. Der Uno sollte mit dem Standard-Firmata-Paket geladen und der USB-Anschluss des Computers auf 57600 Baud konfiguriert sein
BNC-Stecker auf BNC-Stecker - 6 ft	Hosa-Technologie	HOBB6	BNC-Steckverbinder für TTL-Triggerung
Vergoldetes BNC-Stecker-auf-SMA-Koaxialkabel (8,8")	uxcell	6.08642E+11	So schließen Sie die Triggerausgänge der Fluoreszenzkamera
BNC-Drehkopf-Adapter	Hantek	RRBNCTH21	BNC-auf-Bananenstecker-Adapter (4mm)
BNC-Buchse auf Buchse	Diageng	20130530009	Buchse auf Buchse BNC-Adapter zum Anschluss des BNC-Ausgangs der Kamera an den Bananenstecker
Lötfreie, flexible Steckbrett-Überbrückungsdrähte	Z&T	GK1212827	Zum Anschluss der BNC-Trigger-Ausgänge an die Arduiono-Datenerfassung. Stecker auf Stecker.
Leistungsstarke Workstation	PS	Z820	Windows 7, 64 GB RAM, Dual-Xeon-Prozessor, Solid-State-Laufwerk C: -Laufwerk, serieller (RS-232)-Anschluss, mehrere PCIe3-Steckplätze für Ethernet-Konnektivität, USB 3.0-Karten und zusätzliche Solid-State-Laufwerke
M.2-Solid-State-Laufwerk	Samsung (Englisch)	MZ-V5P512BW	Highspeed-Streaming und Analyse von Bilddaten
M.2-Solid-State-Laufwerk-Adapter für Workstations	Lycom	DT-120	M.2-auf-PCIe-3.0-Adapter mit 4 Lanes
Network Attached Storage (Netzwerk)	Synologie	DS-2415+	Speicherung und Analyse von Bilddaten
Festplatten	Western Digital	WD80EFZX	RED 8 TB, 5400 U/min Klasse SATA 6 Gbit/s 128MB Cache 3,5 Zoll. Speicherung von Imaging-Daten (10 Laufwerke + 2 Laufwerke Redundanz)
Software
Fluoreszenz-Erfassung	Hamamatsu	HCImage DIA	Aufnahme von Zweikanal-Fluoreszenzbildsequenzen (GCaMP5 und mCherry) mit 20 fps
Hellfeld-Erfassung	FLIR (ehemals Point Grey Research)	Fliegenfang	Aufnahme von Hellfeld-JPEG-Bildsequenzen
Stage Serieller Port-Leser	Bonsai	https://bitbucket.org/horizongir/bonsai	Erleichtert die Verfolgung von Würmern während des Verhaltens
LED-Controller-Software	Zeiss	Micro Toolbox Test 2011	Zum Einrichten der Intensitäts- und Trigger-Eingänge für die verschiedenen LEDs in der Colibri.2-Einheit
BildJ	Nih	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Einfache Überprüfung von Bildsequenzen und Formatierungsänderungen für den Import in die Ratiometric Quantitation Software
ausstechen	Microsoft	Artikel-Nr.: 2002984-001-000001	Zum Generieren von Teilmengen von kommagetrennten Wertdaten aus Volocity für die MATLAB-Analyse
Peak-Befund	MATLAB (Englisch)	R2017a	Skript für die Berechnung von Ratio-Peak-Features
Ratiometrische Quantifizierung	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Erleichtert die Berechnung ratiometrischer Bildkanäle, die Bildsegmentierung für die Objektsuche und die Verhältnismessung von gefundenen Objekten
skripten
AnalyzeGCaMP_2017 m	MATLAB (Englisch)	Skript für das mittlere Verhältnis und den XY-Schwerpunkt	Analysiert eine ratiometrische Ausgabe in .csv Format, konsolidiert Objekte und Schwerpunktpositionen, berechnet Verhältnisänderungen (ΔR/R), identifiziert Peaks und Peak-Features und schreibt Diagramme (mit und ohne kommentierte Peaks) im Postscript-Format. Für den Import von Matrixdateien gibt das Skript Daten in drei Ordnern aus: analysiert, Peaks und Traces. Die Ausgabe "Analysiert" ist eine Matrixdatei der konsolidierten Objekte mit sechs Spalten (Einheiten): Zeit (s), Fläche (Quadratmikrometer), Verhältnis, X-Schwerpunkt (Mikrometer), Y-Schwerpunkt (Mikrometer) und ΔR/R. Die Ausgabe von "Peaks" ist eine Matrixdatei mit den Zeitpunkten der gefundenen Peaks, der Amplitude (in ΔR/R), der Peakbreite (s), und die Prominenz des Gipfels. Bei der Ausgabe von 'Traces' handelt es sich um Postscript-Dateien mit Kalziumspuren.
XY-stage-final.bonsai	Bonsai	TTL-getriggertes Datenerfassungs- und Stage-Positionslesegerät für serielle Schnittstelle	Zeichnet die Position des X- und Y-Tisches (in Mikrometern) auf, wenn der angeschlossene Arduino während der Bildaufnahme ein positives TTL-Signal von der sCMOS-Kamera empfängt. Das Skript schreibt eine .csv Datei mit vier Spalten: Frame-Nummer, X-Position (Mikrometer), Y-Position (Mikrometer) und die zwischen den Frames verstrichene Zeit (typischerweise ~50 ms bei Aufnahme mit 20 fps). Die X- und Y-Tischposition aus dieser Ausgabe (Spalten 2 bzw. 3) wird zu den X- und Y-Schwerpunktpositionen aus dem AnalyzeGCaM addiert