Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Präparation von standard-künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF)
- Zubereitung der Stammlösung A
- Geben Sie 700 ml destilliertes Wasser in ein sauberes 1-Liter-Becherglas, bevor Sie Chemikalien hinzufügen.
- Unter ständigem Rühren eines Volumens von 500 ml werden 136,75 g NaCl, 6,99 g KCl, 2,89 g MgSO4 und 2,83 g NaH2PO4 zugegeben.
- Fügen Sie mehr destilliertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 1 l zu erreichen. Nach der Verdünnung beträgt die Endkonzentration jeder Verbindung 117 mM NaCl, 4,69 mM KCl, 1,2 mM MgSO4 und 1,18 mM NaH2PO4.
- Im Kühlschrank bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.
- Zubereitung der Stammlösung B
- Geben Sie 700 ml destilliertes Wasser in ein sauberes 1-Liter-Becherglas, bevor Sie Chemikalien hinzufügen.
- Unter ständigem Rühren eines Volumens von 500 ml werden 41,45 g D-Glucose und 41,84 g NaHCO3 zugegeben.
- Fügen Sie mehr destilliertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 1 l zu erreichen. Nach der Verdünnung beträgt die Endkonzentration jeder Verbindung 11,5 mM D-Glucose und 24,9 mM NaHCO3.
- Im Kühlschrank bei 4 °C bis zu 2 Wochen aufbewahren.
- Vor jedem Versuch 50 ml Brühe A mit 50 ml Brühe B mischen und mit destilliertem Wasser auf 1 l bringen, um die aLiquf-Lösung zu erhalten, und bei RT belassen, während sie mindestens 30 Minuten lang kontinuierlich mit Carbogen (95 % O2 - 5 % CO2 -Mischung) sauerstoffangereichert wird. Die Endkonzentration aCSF erst zu Beginn jedes Versuchs zubereiten und am Ende des Tages verwerfen.
>2. Herstellung von Saccharose-künstlichem Liquor cerebrospinalis (Saccharose-aCSF)
- Zubereitung der Stammlösung C
- Geben Sie 700 ml destilliertes Wasser in ein sauberes 1-Liter-Becherglas, bevor Sie Chemikalien hinzufügen.
- Unter ständigem Rühren von 500 ml destilliertem Wasser 240 g Saccharose, 6,55 g NaHCO3, 0,671 g KCl, 4,88 g MgCl2, 0,22 g CaCl2 und 0,21 g Ascorbinsäure hinzufügen.
- Fügen Sie mehr destilliertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 1 l zu erreichen. Nach der Verdünnung beträgt die Endkonzentration jeder Verbindung 701,1 mM Saccharose, 78 mM NaHCO3, 9 mM KCl, 24 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2 und 1,2 mM Ascorbinsäure.
- Halten Sie die Stammlösung C bis zu einer Woche bei 4 °C.
- Vor jedem Versuch werden 300 ml von 50 ml Stamm C mit 600 ml destilliertem Wasser gemischt, um die Saccharose-aCSF-Lösung in der Endkonzentration zu erhalten. Bei RT stehen lassen und dabei mindestens 30 Minuten lang kontinuierlich mit Carbogen (95 % O2 - 5 % CO2 -Mischung) sauerstoffhaltig zuführen.
>3. Vorbereitung der Scheibe
- Legen Sie ein sauberes Becherglas mit 100 ml Saccharose-aCSF-Lösung in Eis, während Sie es mit Carbogen sauerstoffreichern, und fixieren Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät auf 7,4, während Sie einige Tropfen 0,1 M NaOH-Lösung (bei pH-Wert < 7,4) oder 0,1 M HCl-Lösung (bei pH-Wert > 7,4) hinzufügen.
- Füllen Sie eine Schneidkammer eines Vibratoms mit Saccharose-aCSF und sauerstoffisieren Sie es. Schalten Sie das an die Schneidkammer gekoppelte Kühlsystem auf Glycerinbasis ein und warten Sie 15 Minuten, bis es auf 0 - 4 °C abgekühlt ist.
- Betäuben Sie Rattenbabys (im Alter von 9 bis 12 Jahren von erwachsenen zeitschwangeren Sprague-Dawley-Ratten) mit Ketamin (70 mg/kg, i.p.; bei < 50 μl Endvolumen). Wenn der Welpe ruhig ist, vergewissern Sie sich, dass der Schwanzklemmreflex fehlt.
- Welpen enthaupten.
- Schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Skalpellklinge aus Kohlenstoffstahl in Längsrichtung von vorne nach hinten ein und ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette zur Seite. Schneide den Knochen, der das Gehirn bedeckt, bewege die Schere seitlich und entferne sie vollständig, um das Gehirn freizulegen.
- Entfernen Sie dann schnell das Gehirn mit einem Spatel (der zunächst unter dem Riechkolben platziert wird, um ihn sanft aus dem rostralsten zu den kaudalsten Bereichen herauszudrücken). Schieben Sie das Gehirn vorsichtig in eisgekühlte, sauerstoffhaltige Saccharose-künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (Saccharose-aCSF).
- Machen Sie einen parasagittalen Schnitt an der rechten Hemisphäre (wobei etwa ein Drittel der Hemisphäre entfernt wird) und kleben Sie die getrimmte Seite des Gehirns auf eine Metallscheibe, die magnetisch an der Schneidkammer eines Vibroslicers befestigt wird, um sagittale 400-μm-Abschnitte zu schneiden, die den pedunkulopontinen Kern (PPN) enthalten. Halten Sie die PPN-Scheiben 45 Minuten lang auf RT, bevor Sie Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen machen.
>4. Aufzeichnungen von Gamma-Band-Oszillationen in PPN-Schichten
- Herstellung von Kalium-Gluconat-Intrazellulärer Lösung (High-K+-Lösung)
- Legen Sie ein sauberes Becherglas mit 10 ml destilliertem Wasser in Eis. Unter ständigem Rühren hinzufügen: K+-Gluconat, 90,68 mg Phosphokreatin di Tris-Salz, 47,66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40,58 mg Mg2+-ATP und 4 mg Na+2-GTP.
- Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,3 ein (100 mM in destilliertem Wasser). Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 20 ml zu erreichen. Falls erforderlich, stellen Sie die Osmolarität mit Saccharose (100 mM in destilliertem Wasser) auf 280 - 290 mOsm ein. Nach der Verdünnung beträgt die Endkonzentration jeder Verbindung 124 mM K+-Gluconat, 10 mM Phosphokreatin di Tris-Salz, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 4 mMMg 2+-ATP und 0,3 mM Na+2-GTP.
- Intrazelluläre Lösungen in 1-ml-Röhrchen aliquotieren und bei -20 °C einfrieren. Ein Aliquot pro Tag verwenden und während der Experimente bei 4 °C aufbewahren.
- Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen
- Legen Sie die Scheiben in eine Tauchkammer und perfundieren Sie sie (1,5 ml/min) mit sauerstoffhaltigem (95 % O2 - 5 % CO2 ) aCSF, das die folgenden Rezeptorantagonisten enthält: selektiver NMDA-Rezeptorantagonist 2-Amino-5-phosphonovaleriansäure (APV, 40 μM), kompetitiver AMPA/Kainat-Glutamatrezeptorantagonist 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX, 10 μM), Glycinrezeptorantagonist Strychnin (STR, 10 μM), der spezifische GABA-A-Rezeptor-Antagonist Gabazin (GBZ, 10 μM) und der Natriumkanalblocker Tetrodotoxin (TTX, 3μM)
Füllen Sie die Aufzeichnungspipetten (Widerstand 2-7 MΩ; hergestellt aus normalen, im Handel erhältlichen dickwandigen Borosilikatglaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,0 mm und einem Innendurchmesser von 0,6 mm) mit intrazellulärer High-K+-Lösung unter Verwendung handelsüblicher Patch-Pipettenfüller mit Lösungsfilter. Setzen Sie die Pipette in die Halterung des Verstärkers ein. Üben Sie einen kleinen Überdruck mit einer 1-ml-Spritze aus, die mit einem Silikonschlauch, der mit einem Dreiwegeventil verbunden ist, mit dem Pipettenhalter verbunden ist. Verbinden Sie die Rückseite des Pipettenhalters mit einem Patch-Clamp-Verstärker.
- Bewegen Sie die Aufnahmepipette mit einem mechanischen Mikromanipulator in die Nähe des PPN-Kerns und verwenden Sie ein 4X-Objektiv in Kombination mit einer Kontrastoptik für den Nahinfrarot-Interferenz.
Anmerkung: Der PPN-Kern kann in Schnitten dorsal des oberen Kleinhirnstiels (SCP; beobachtbar als dickes Bündel von Axonen) beobachtet werden. Die Aufzeichnungspipetten befanden sich im PPN pars compacta, der sich unmittelbar dorsal des hinteren Endes des Stiels befindet.
- Bringen Sie die Aufzeichnungspipette in Kontakt mit einem PPN-Neuron, während Sie sie mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse visualisiert, und wenden Sie schnell einen negativen Sog an, um eine Versiegelung mit der Zelle zu bilden.
- Verwenden Sie die Voltage-Clamp-Seal-Software, um den Pipettenwiderstand während des negativen Saugens gemäß dem Protokoll des Herstellers zu überwachen.
- Wenn die negative Saugleistung langsam erhöht wird und die Widerstandswerte, die vom Patch-Clamp-Monitor an der Spitze der Pipette abgelesen werden, 80 - 100 MOhm erreichen, ändern Sie schnell das Haltepotenzial auf -50 mV und lassen Sie den Unterdruck ab. Beginnen Sie mit der kontinuierlichen Anwendung eines negativen Sogs, bis die Membran des Neurons aufreißt und der elektrische Zugang in der Ganzzellkonfiguration erreicht ist.
- Wenn die von der Voltage-Clamp-Seal-Software gemessenen Zugangswiderstandswerte 10 MOhm oder mehr betragen, üben Sie weiterhin einen negativen Sog in kleineren Mengen aus.
- Kompensieren Sie die Kapazität (d. h. langsame und schnelle Transienten, die nach dem Aufbrechen der Membran der Zelle beobachtet werden) und den Serienwiderstand im Voltage-Clamp-Modus. Schalten Sie den Aufnahmemodus auf die Stromzange um und kompensieren Sie schnell Bridge-Werte (z. B. durch Bewegen des Verstärkerreglers oder Klicken auf das Menü für die automatische Kompensation mit der Maus des Computers).
- Kontinuierliche Überwachung des Ruhemembranpotentials des PPN-Neurons, das mit dem Protokoll des Herstellers aufgezeichnet wird. Wenn sich das Ruhepotenzial der Membran in Richtung depolarisierender oder hyperpolarisierender Werte verschiebt, verwenden Sie kleine Gleichstrommengen (bis zu 100 pA), um den optimalen Endwert von -50 mV beizubehalten.
Anmerkung: Halten Sie nur PPN-Neuronen mit einem stabilen Ruhemembranpotential (RMP) von -48 mV oder mehr hyperpolarisiert (d. h. RMP < -48 mV).
