Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Summary

Eine Methode ist beschrieben, einzeln auswählen, bearbeiten und Bild zu leben Erreger mit einer optischen Falle gekoppelt an eine sich drehende Scheibe Mikroskop. Die optische Falle bietet räumliche und zeitliche Steuerung von Organismen und legt sie neben Wirtszellen. Fluoreszenzmikroskopie erfasst dynamische interzelluläre Wechselwirkungen mit minimaler Störung der Zellen.

Abstract

Dynamische Live Cell Imaging ermöglicht die direkte Visualisierung von Echtzeit-Interaktionen zwischen den Zellen des Immunsystems ^{1, 2,} aber der Mangel an räumlicher und zeitlicher Steuerung zwischen den Fresszellen und Mikroben geleistet hat Beobachtungen in den ersten Interaktionen von Wirt Reaktion auf Krankheitserreger konzentrieren schwierig. Historisch gesehen haben interzellulären Kontakt Veranstaltungen wie Phagozytose ³ durch Mischen von zwei Zelltypen abgebildet worden, und dann kontinuierlich Scannen der field-of-view, um serendipitous interzellulären Kontakte auf der entsprechenden Stufe der Interaktion zu finden. Die stochastische Natur dieser Ereignisse macht dieses Verfahren langwierig, und es ist schwer zu früh oder flüchtige Ereignisse in Zell-Zell-Kontakt durch diesen Ansatz zu beobachten. Diese Methode erfordert finden Zellpaaren, dass am Rande der Kontakt sind, und beobachtet sie, bis sie vollendet ihre Kontaktdaten, oder nicht. Um diese Einschränkungen nutzen wir optische Fallen als nicht-invasive, nicht-destruktive, sondern eine schnelle und effektive Methode, um Zellen in Kultur positionieren.

Optische Fallen oder optische Pinzette, sind zunehmend in der biologischen Forschung eingesetzt, um zu erfassen und physisch zu manipulieren Zellen und anderen Mikrometergröße Teilchen in drei Dimensionen ^4. Strahlungsdruck wurde zum ersten Mal beobachtet und auf optische Pinzette-Systeme in 1970 ^{5, 6,} und wurde zum ersten Mal verwendet werden, um biologische Proben im Jahr 1987 ^{7 zu} steuern. Seither haben optische Pinzette in eine Technologie ausgereift, um eine Vielzahl biologischer Phänomene ^8-13 Sonde.

Wir beschreiben eine Methode, ^14, die Fortschritte Live Cell Imaging durch die Integration einer optischen Falle mit Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie mit Temperatur und Luftfeuchtigkeit auf exquisite räumliche und zeitliche Steuerung von pathogenen Organismen in einer physiologischen Umgebung bieten, um Wechselwirkungen mit Wirtszellen, wie die ermittelten erleichtern Betreiber. Live, wurden pathogene Organismen wie Candida albicans und Aspergillus fumigatus, die tödlich enden, invasive Infektionen bei immungeschwächten Personen ^{15, 16} (z. B. AIDS, Chemotherapie und Organtransplantation Patienten) kann dazu führen, optisch gefangen mit zerstörungsfreien Laserintensitäten und zog neben Makrophagen, die den Erreger phagozytieren können. Hohe Auflösung, Durchlicht und Fluoreszenz-basierten Filmen etabliert die Fähigkeit zur frühen Ereignisse der Phagozytose in lebenden Zellen zu beobachten. Zur Demonstration der breiten Anwendbarkeit in der Immunologie, wurden primäre T-Zellen auch gefangen und manipuliert werden, um Synapsen mit anti-CD3 beschichteten Mikrokügelchen in vivo bilden und Zeitraffer-Bildgebung der Synapsenbildung wurde ebenfalls erhalten. Durch die Bereitstellung einer Methode, um feine räumliche Steuerung von Live-Erreger in Bezug auf Immunzellen ausüben können zelluläre Interaktionen mittels Fluoreszenzmikroskopie mit minimaler Störung von Zellen aufgenommen werden und können leistungsfähige Einblick in frühen Reaktionen der angeborenen und erworbenen Immunität zu erhalten.

Protocol

1. Kultur Bedingungen von Krankheitserregern für optische Fallen

1. Wachsen A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) auf einem semi-Agar-Medien mit SBD (Sabouraud Dextrose) bei 30 ° C für 3 Tage.
2. Wachsen C. albicans (SC5314) in YPD (Hefe-Pepton Dextrose) Flüssigkultur mit 100 ug / ml Ampicillin über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C.

2. Vorbereitung von Krankheitserregern für Fluoreszenzmarkierung

1. Ernte gewünschten Betrag von Krankheitserregern und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß.
2. Add 300 ul Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), um Reaktionsgefäß.
3. Mit Ultraschall-Ge....

Discussion

In dieser Arbeit verwenden wir einen optischen Falle auf Krankheitserreger mit Abmessungen zwischen 3 um einzufangen - 5 pm. Obwohl Krankheitserreger von Interesse für unser Labor in der Regel diese Dimensionen haben, ist die optische Pinzette hier beschriebene System flexibel auf eine Vielzahl von Größen Falle. In der Tat optische Fallen wurden verwendet, um Partikel von einzelnen Atomen, Zellen etwa 10 um im Durchmesser erfassen. Zusätzlich wurde diese optische Fallen System in der Lage, Partikel in verschiedenen Form.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
A. fumigatus			Albino-Stamm, B-5233/RGD12-8, Geschenk von KJ Kwon-Chung, NIH
C. albicans			SSY50-B-Mutante, Geschenk von Eleftherios Mylonakis, MGH, SC5314-Stamm, Geschenk von Gerald Fink, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488	Invitrogen	± 20000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A20006
Dimethylformamid	Sigma	D4551
Frisches Blut			Gift aus RJW Heath, MGH, HMS
Nikon inversen Mikroskop	Nikon		Modell Ti-E
Trapping-Laser, ChromaLase	Blue Sky Research	CLAS-106-STF02-02
Fluoreszenz-Anregungs-Laser	Kohärent		Modell Innova 70C
Breadboards zum Einfangen von Komponenten	Thorlabs	MB1224, MB1218
Optische Lufttisch	Technische Manufacturing Corporation
Elektronischer Verschluss mit Pedal	Uniblitz		Gekauft von Vincent Associates, Rochester, NY
Singlemode Glasfaser	Oz Optics	PMJ-3S3S-1064-6
Fiber Stellungsregler	Thorlabs	PAF-X-5-C
Faserkollimator	Oz Optics	HPUCO-23 bis 1064-P-25AC
Objektive für Teleskop	Thorlabs	AC254-150-B	Brennweite von 150 mm
Übersetzung Stufen (x, y, z)	Newport	M-461-XYZ
IR dichroitischen Spiegel	Chroma	ET750-sp-2P8
Objektiv (100X)	Nikon		NA = 1,49, Öl-Immersion, TIRF Ziel
Konfokale Kopf	Yokogawa	CSU-XI
Polarizer	Nikon	MEN51941
Wollaston-Prisma	Nikon	MBH76190
EM-CCD-Kamera	Hamamatsu	C9100-13
CCD-Kamera (ORCA ER)	Hamamatsu	C4742-80-12AG
Filterrad	Ludl	99A353
Filterrad	Sutter	LB10-NWE
Chambered Deckglas	Lab-Tek/Nunc	155409
Dynabeads	Invitrogen	111-51D	Beschichtet mit anti-CD3
Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)	Invitrogen / Gibco	10313
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen / Gibco	15140-122
L-Glutamin	Invitrogen / Gibco	25030-081
Fetal Bovine Serum (HyClone)	ThermoScientific	SH30071.03