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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Herstellung von Headsets mit zwei bipolaren Elektroden (Abbildung 1)
- Schneiden Sie 3,5 cm rostfreien, mit Polytetrafluorethylen beschichteten Edelstahldraht ab.
- Ziehen Sie an beiden Enden ca. 1 mm der Isolierschicht vom Draht ab. Lassen Sie nicht zu viel von dem Draht abisolieren.
- Setzen Sie zwei Stifte auf einen Schraubstockhalter, wobei der untere Teil des Stifts einen längeren Schlitz nach unten zeigt.
- Tragen Sie Flussmittel auf die abisolierten Enden des Drahtes und auf die Spitzen der Stifte auf.
- Verzinnen Sie den abisolierten Teil des Drahtes mit gerade so viel Lötmittel, dass er beschichtet ist.
- Geben Sie eine minimale Menge Lötzinn auf die Oberseite des Stifts, ohne an den Seiten überzulaufen.
- Stecken Sie ein Ende der abisolierten Enden des Drahtes so tief wie möglich in den Stift, während das Lot geschmolzen ist.
Anmerkung: Es gibt ein seitliches Loch, aus dem der Draht herauskommen kann - lassen Sie den Draht nicht aus dem Stift herauskommen. Der gesamte abisolierte Draht muss innerhalb des Stifts bleiben.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.6 bis 1.7 für den zweiten Stift, jetzt mit den anderen abisolierten Enden des Drahtes.
- Lassen Sie die Stifte 30 s lang aushärten, entfernen Sie sie aus dem Schraubstockhalter und ziehen Sie dann daran, um sicherzustellen, dass die Verbindung zwischen dem Draht und den Stiften fest ist und hält.
- Spülen Sie die Stecknadeln in kaltem Wasser ab und trocknen Sie sie dann.
- Überprüfen Sie den Leitwert zwischen Pin 1 und Pin 2 mit einem Ohmmeter.
- Bringen Sie die Stifte an den Enden des Drahtes zusammen, halten Sie sie parallel und schließen. Klemmen Sie ein Blutstillmittel in die Mitte des Drahtes. Drehen Sie dann den Hämostaten, so dass sich der Draht ziemlich fest um sich selbst dreht. Entfernen Sie den Hämostaten.
- Klemmen Sie eine Pinzette 2 mm unterhalb der Stifte auf den verdrillten Draht und biegen Sie den Draht um 90°.
- Schieben Sie denselben Draht erneut um 90° zurück über die Pinzette, wobei Sie eine weitere Biegung 1 mm vom ersten erzeugen.
- Schneiden Sie den verdrillten Draht in einem 45°-Winkel unterhalb der Biegung bei 3,5 mm mit einer kleinen scharfen Schere ab.
- Bereiten Sie zwei dieser bipolaren (doppelt verdrillten) Elektroden für jedes Headset vor (optional, die zweite ist ein Backup für den Fall, dass es elektrische Probleme mit dem ersten gibt).
- Bereiten Sie eine einzelne Referenzelektrode vor, indem Sie einen Draht mit an beiden Enden gelöteten Stiften in zwei Teile schneiden (Schritte 1.1-1.17, Abbildung 1A).
- Den Draht bei 7 mm abschneiden.
- Biegen Sie das Ende 1 mm unterhalb der Spitze.
- Decken Sie dann die gebogene 1 mm Spitze des Drahtes mit einer Pinzette ab und drehen Sie den Draht fest um die Pinzette, um eine kleine Schlaufe (1 mm Durchmesser) zu erzeugen.
- Biege die Schlaufe senkrecht zum geraden Teil des Drahtes, so dass die Drahtspitze wieder nach außen zeigt.
- Montieren Sie die beiden bipolaren Elektroden und die einzelne Referenzelektrode so in den sechspoligen Sockel, dass die bipolaren Elektroden mit einem Abstand von 6 mm nebeneinander liegen und die Referenzelektrode in der mittleren äußeren Öffnung platziert wird (Abbildung 1B).
Anmerkung: Eine alternative Methode besteht darin, die Elektroden zu implantieren, sie fest zu zementieren und dann ihre Stifte in den Sockel einzusetzen.
>2. Stereotaktische Elektrodenimplantation
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und die sechspolige Elektrodenbaugruppe vor der Operation durch Autoklavieren. Während der Operation muss ein steriles Operationsfeld aufrechterhalten werden, und es müssen sterile OP-Handschuhe verwendet werden. Sterile Abdecktücher (z. B. Press n' Seal) werden empfohlen, um das Tier mit Ausnahme des Operationsbereichs abzudecken.
- Verwenden Sie 8 Wochen alte VGAT-Cre-Mäuse (die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des vesikulären GABA-Transporter-Gens [VGAT] exprimieren, altersangepasst, sowohl männlich als auch weiblich) für Operationen 4 Wochen nach der Entwöhnung. Erfassen Sie das Gewicht des Tieres vor der Operation, um die Messung des postoperativen Gewichtsverlusts zu ermöglichen.
- Verwenden Sie einen zertifizierten Isofluran-Verdampfer oder ein Anästhesiesystem mit niedrigem Durchfluss, das mit einer Präzisionsspritzenpumpe, einem integrierten digitalen Verdampfer und einem Feedback-Wärmekissen ausgestattet ist.
Anmerkung: Low-Flow-Systeme sind in der Lage, eine Anästhesie mit niedrigen Flussraten proportional zur Größe des Tieres entweder in eine Induktionskammer oder durch einen Nasenkonus auf dem stereotaktischen Rahmen zu verabreichen (70 ml/min, die Isoflurankonzentration in der Luft beträgt 4 % für die Induktion und 2 % für die Operation). Der Einsatz von weniger Anästhesie kommt nicht nur dem Tier bei Operationen zugute, sondern verringert auch das Risiko, dass das Laborpersonal Isofluran ausgesetzt ist.
- Legen Sie das anästhesierte Tier auf ein auf 37 °C erwärmtes Heizkissen, um es während der Operation warm zu halten. Wenn Sie ein rückkopplungsgesteuertes Temperatursystem verwenden, führen Sie den leicht geschmierten Temperaturfühler zur Temperaturüberwachung während der Operation in das Rektum des Tieres ein.
- Montieren Sie das Tier auf dem stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Ohrbügel vorsichtig in die Ohren und die vorderen oberen Zähne in den Schneidezahn einsetzen. Platzieren Sie den Nasenkegel über der Nase, um eine korrekte Anästhesie zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass der Kopf nivelliert und zentriert ist und nicht bewegt werden kann, wenn er leicht angetastet wird.
- Injizieren Sie subkutan 0,5 ml Normosol zur Hydratation.
- Tragen Sie Augengleitmittel auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
- Überwachen Sie die Narkosetiefe durch das Fehlen des Entzugsreflexes nach dem Einklemmen einer Zehe der Hintergliedmaßen und verringern Sie dann das Isofluran während der Operation auf 1,5 % bis 2,0 %.
- Entfernen Sie die Haare im und um den Operationsbereich herum, indem Sie sie zupfen oder eine Haarschneidemaschine (Rasieren) oder Enthaarungscreme verwenden, und desinfizieren Sie die Haut mit drei Zyklen abwechselnder Anwendung von Jod und Ethanol, zum Schluss mit Jod. Die Entfernung von Haaren von der Operationsstelle wird nur empfohlen, wenn es Mittel gibt, die Anästhesie an dieser Stelle aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie bei Bedarf in Alkohol getauchte Wattestäbchen-Applikatoren, um Haare aus der unmittelbaren Umgebung des Kopfes zu entfernen. Injizieren Sie 0,05 ml des lokalen Analgetikums Bupivacain (0,25%) subkutan.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt am Schädel und schneiden Sie dann mit einer scharfen chirurgischen Schere einen Teil der Haut heraus, wodurch der Schädel freigelegt wird. Schieben Sie die Haut mit einem Wattestäbchen zur Seite und reinigen Sie den Schädel von allen Muskeln und dem darunter liegenden Gewebe, die die Sicht behindern.
Anmerkung: Um versehentliche Blutungen zu stoppen, üben Sie mit einem sterilen Wattestäbchen Druck auf die Blutungsstelle aus, bis sie aufhört.
- Reinigen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid und verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um die Schädelnähte und sowohl Bregma als auch Lambda sichtbar zu machen.
- Trocknen Sie den Schädel gründlich ab und tragen Sie dann einen Tropfen selbstätzenden Zahnkleber mit dem Applikator auf. Bürsten Sie es in den Schädel, warten Sie 60 s und härten Sie es 40 s lang mit einem zahnärztlichen UV-Licht aus. Eine glänzende Oberfläche zeigt an, dass der Klebstoff effektiv mit dem Schädel vernetzt wurde.
Anmerkung: Dieser Schritt ist entscheidend für die sichere Befestigung des Headsets.
- Bohren Sie mit einem 0,031" Bohrer (0,79 mm) beidseitig zwei Bohrlöcher für die Implantation von Hippocampus-Tiefenelektroden (ca. 5.000 U/min). Bohren Sie ein zusätzliches Bohrloch für die Referenzelektrode oberhalb des Kleinhirns hinter dem Lambda.
HINWEIS: Achten Sie beim Bohren darauf, den Bohrer langsam abzusenken und vermeiden Sie es, in das Gehirn zu bohren.
- Die Koordinaten für die Elektroden sind wie folgt (von Bregma in mm): Hippocampus-Elektroden an 3 mm posterior, 3 mm lateral und 3 mm Tiefe; und zerebelläre Referenzelektrode an 6 mm posterior, 0 mm lateral und 0 mm Tiefe (subdural).
- Um die Genauigkeit zu erhöhen, verwenden Sie einen stereotaktisch gelagerten Bohrer, stellen Sie die X/Y-Achse des stereotaktischen Manipulators bei Berührung von Bregma auf Null - dies ist der Bezugspunkt für die Koordinaten.
- Montieren Sie ein Headset, indem Sie alle Elektroden in den sechspoligen Sockel einführen und darauf achten, dass die Stifte ganz in den Sockel geschoben sind. Montieren Sie den Sockel in den Elektrodenhalter auf einem stereotaktischen Rahmen (Abbildung 1B).
- Richten Sie die Elektroden über den entsprechenden Fräslöchern aus. Stereotaktisch verdrillte bipolare Edelstahldrahtelektroden im rechten und linken Hippocampus und Referenzelektrode in das Kleinhirn implantieren, indem Sie das Headset langsam absenken und die Elektroden in die Bohrlöcher führen.
- Wenn sich die Hippocampus-Drehelektrode direkt über dem Loch befindet, stellen Sie die Z-Achse auf Null und senken Sie sie langsam auf -3,0 mm ab.
- Decken Sie die Schädeloberfläche und die Elektroden mit Zahnzement ab und füllen Sie den Raum zwischen der Schädeloberfläche und der Unterseite des Sockels aus. Die Hautränder grenzen an den Zahnzement an, so dass kein darunter liegendes Gewebe freiliegt. Warten Sie, bis der Zement getrocknet und ausgehärtet ist. Lösen Sie dann den Elektrodenhalter vom stereotaktischen Arm und entfernen Sie den Halter vom Sockel.
- Injizieren Sie 0,1 ml Ketoprofen (1 mg/ml, subkutan [SC]) zur Analgesie und eine zweite Dosis von 0,5 ml Normosol (SC) zur Hydratation und entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen.
- Legen Sie ein auf 37 °C vorgeheiztes isothermes Pad in einen leeren Vivariumkäfig, der mit einem Papiertuch bedeckt ist. Sobald es vollständig wach ist, setzen Sie das Tier in einen sauberen Käfig mit Einstreu und weichem Futter und bringen Sie es zurück ins Vivarium. Ab diesem Zeitpunkt werden die Tiere einzeln untergebracht, um ein gegenseitiges Kauen an den Headsets zu verhindern. Drahtstangentrichter werden nicht verwendet, um zu verhindern, dass die Headsets stecken bleiben, sondern Wasserflaschen werden an die Unterseite der Käfigoberseiten gebunden, und das Chow befindet sich in der Einstreu.
- Füttern Sie das Tier 72 Stunden nach der Operation mit weichem Futter und überwachen Sie den Gewichtsverlust und den Body Condition Score. Dehydrierten Tieren können 0,5 ml Normosol subkutan verabreicht werden, wenn sie dehydriert sind (Gewichtsverlust, vermehrter Hautturgor, eingefallene Augen). Ketoprofen kann nach der Operation noch 2 Tage lang einmal täglich subkutan verabreicht werden (befolgen Sie das Analgesieschema gemäß den Richtlinien des örtlichen institutionellen Komitees für Tierpflege und -verwendung [IACUC]). Lassen Sie die Tiere 4-7 Tage lang vollständig in ihren Käfigen genesen, bevor sie in das Elektroenzephalographie (EEG)-Aufzeichnungssystem überführt werden.
