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Haftungsausschlusstext: Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Immunfluoreszenz-Färbung
- Objektträger bei -80 °C herausnehmen. Objektträger 1 h lang auf RT halten, um die Abschnitte an der Luft zu trocknen. Spülen Sie die Objektträger dreimal für jeweils 5 Minuten in 0,1 % PBST (0,1 % Polyethylenglykol-tert-octylphenylether in PBS; siehe Materialtabelle) aus, um die OCT- und Permeabilisierungsabschnitte auszuwaschen.
- Führen Sie optional eine Antigen-Retrieval durch (optional).
- Den Citratpuffer (10 mM Natriumcitrat pH 6) in der Färbeschale mit einem Dampfgarer oder Wasserbad auf 95–100 °C vorheizen. Die Objektträger in den Citratpuffer tauchen und 10 min inkubieren.
- Nehmen Sie die Färbeschale aus dem Dampfgarer oder Wasserbad und kühlen Sie die Objektträger 20 Minuten oder länger bei Raumtemperatur ab15.
Anmerkung: Verwenden Sie alternativ Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 0,05 % Tween 20, pH 9,0) oder EDTA-Puffer (1 mM EDTA, 0,05 % Tween 20, pH 8,0) für die hitzeinduzierte Antigengewinnung. Verwenden Sie zusätzlich zum Heißdampfer einen Schnellkochtopf, eine Mikrowelle oder ein Wasserbad für die hitzeinduzierte Antigenentnahme. Eine enzyminduzierte Antigengewinnung mittels Trypsin oder Pepsin ist eine weitere Alternative. Optimieren Sie die Konzentration und Behandlungszeit der enzymatischen Entnahme, um schädliche Schnitte zu vermeiden. Optimieren Sie die Antigen-Retrieval-Methode für jede Antikörper/Antigen-Kombination.
- Inkubieren Sie jeden Objektträger mit 200 μl Blockierungslösung (5 % Eselsserum, verdünnt in 0,1 % PBST) bei RT für 30 Minuten, dann entfernen Sie die Blockierungslösung ohne Spülung.
- Inkubieren Sie jeden Objektträger mit 100 μl Primärantikörper oder Primärantikörpern, verdünnt in Blockierungslösung für 1 h bei RT oder O/N bei 4 °C. Spülen Sie die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten bei RT mit PBS.
- Inkubieren Sie jeden Objektträger mit 100 μl Sekundärantikörper, verdünnt in Blockierungslösung, für 1 h bei RT. Spülen Sie die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten bei RT in PBS. Schützen Sie die Objektträger vor Licht.
- Montieren Sie Folien.
- Geben Sie zwei Tropfen Anti-Fade-Medium mit DAPI (4', 6-Diamidino-2-phenylindol) auf den Objektträger. Dann mit einem Deckglas abdecken.
- Bis zum Abbild bei 4 °C im Dunkeln lagern.
Anmerkung: Alternativ können die Zellkerne zuerst mit DAPI oder Hoechst 33324 Farbstoff markiert werden, der in PBS bei RT im Verhältnis 1:2.000 verdünnt ist, und dann mit Glycerin mounten.