Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Organotypische Schnittvorbereitung und -kultur im Hippocampus
HINWEIS: Dieses Protokoll erlaubt die Herstellung von organotypischen Hippocampus-Schnitten. Im Idealfall sollten nicht mehr als drei Tiere in einer Sitzung eingeschläfert und präpariert werden, um sicherzustellen, dass jeder Schritt schnell durchgeführt wird und die Qualität der Scheiben nicht beeinträchtigt wird. Verwenden Sie durchgehend eine aseptische Technik.
- Stellen Sie sicher, dass die folgenden Schritte ausgeführt werden, bevor Sie das Präparierprotokoll starten.
- Vorbereiten und filtrieren: Sterilisieren Sie alle Lösungen im Voraus mit einem 0,22-μm-Filter.
- Halten Sie die Lösungen während der Lagerung und während der gesamten Hirndissektion und der Vorbereitung der Hippocampusschnitte bei 4 °C, indem Sie die Vorratsbehälter und Petrischalen immer auf einem Metallkühlkörper aufbewahren und auf nassem Eis sitzen.
- Autoklavieren Sie alle Metallinstrumente, Ringe und Papiertaschentücher.
- Stellen Sie sicher, dass alle Instrumente und Materialien, die für jeden Schritt des Protokolls verwendet werden sollen, gebrauchsfertig sind, im Voraus ausgelegt und mit 70 % Ethanol besprüht sind. Lassen Sie sie dann abkühlen und trocknen.
- Euthanasieren Sie ein 5–7 Tage altes C57BL/6N-Mausbaby durch Gebärmutterhalsluxation und wischen Sie die gesamte Hautoberfläche kurz mit sterilem, in 70%igem Ethanol getränktem Papiertuch ab. Tupfen Sie die Haut trocken und enthaupten Sie den Welpen mit einer Mayo-Schere.
- Schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Irisschere entlang der Mittellinie des Kopfes ein, beginnend im Hinterhauptbereich und endend in der Nähe der Schnauze, und ziehen Sie sie seitlich zurück.
- Führen Sie die Spitze der Vannas-Schere in das Foramen magnum ein und machen Sie zwei kleine seitliche Schnitte am Knochen entlang der Quernebenhöhlen, dann schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie bis zum Riechkolben und machen Sie zwei kleine Schnitte senkrecht zur Mittellinie in diesem Bereich.
- Ziehen Sie mit einer fein gekrümmten Pinzette die Knochenlappen seitlich von der Mittellinie weg zurück. Entnehmen Sie das Gehirn vorsichtig mit einem kleinen Spatel und geben Sie es in eine 90 mm starke, mit Silikonelastomer beschichtete Petrischale, in der sich ein "Seziermedium" befindet.
Anmerkung: Das Seziermedium ist die ausgewogene Salzlösung von Gey (5 mg/ml D-Glukose, 1% ige antibiotisch-antimykotische Lösung, 10.000 Einheiten/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin und 25 μg/ml Amphotericin B).
- Entferne das Kleinhirn und trenne die Gehirnhälften entlang der Mittellinie mit einer Rasierklinge. Übertragen Sie die Gehirnhälften mit einem Spatel in eine neue, mit Silikonelastomer beschichtete 90-mm-Petrischale, die mit frischem, eiskaltem Dissektionsmedium gefüllt ist. Wenn mehr als ein Tier in einer Sitzung verwendet werden soll, wiederholen Sie die Schritte 1.2 bis 1.6.
- Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop mit einer Rasierklinge den Riechkolben und die Spitze der Stirnrinde ab und trennen Sie die Großhirnrinde mit einer Pinzette mit feiner Spitze vom restlichen Hirngewebe. Bei diesem Schritt liegt der Hippocampus auf der medialen Oberfläche des kortikalen Gewebes frei. Verwenden Sie ab diesem Schritt eine Laminar-Flow-Gewebekulturhaube (ultraviolett sterilisiert und mit einer 70%igen Ethanollösung gereinigt).
- Tragen Sie eiskaltes Seziermedium auf eine flache Kunststoff-Hackscheibe auf und positionieren Sie das Hirngewebe mit einem Spatel so auf der Scheibe, dass die mediale Oberfläche der Rinde nach oben zeigt und die Achse des Hippocampus senkrecht zur Achse des Hackmessers steht.
- Entfernen Sie das Seziermedium so weit wie möglich mit einer Pasteurpipette mit feiner Spitze von der Hackscheibe.
- Schneiden Sie das Gehirn mit einem Gewebehacker bei einer Zerkleinerungsgeschwindigkeit und -kraft von 50 % in 400 μm große Scheiben.
Anmerkung: Dieser Schritt muss so schnell wie möglich abgeschlossen werden, da das Hirngewebe nicht in das Dissektionsmedium eingetaucht wird.
- Ersetzen Sie das Seziermedium in der mit Silikonelastomer beschichteten Petrischale durch das frische eiskalte Medium.
- Sobald der Gewebehacker fertig ist, tauchen Sie das Hirngewebe vorsichtig in ein frisches Präpariermedium und übertragen Sie das geschnittene Gewebe mit einem Skalpell mit gerader Klinge zurück in die 90 mm starke, mit Silikonelastomer beschichtete Petrischale.
- Trennen Sie die kortikalen Scheiben unter einem Stereomikroskop vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze. Untersuchen Sie für jede Scheibe den Hippocampus auf Morphologie und mögliche Gewebeschäden, die durch die Dissektion oder das Schneiden entstehen.
- Trennen Sie die Hippocampi von der entorhinalen Rinde und von den Fimbrien mit einer feinen Pinzette und einer kleinen Vannas-Schere. Typischerweise werden etwa 6 bis 8 Hippocampusschnitte pro Hemisphäre erzeugt.
- Übertragen Sie bis zu 6 Hippocampus-Scheiben mit einer geschnittenen Pasteurpipette auf einen Gewebekultureinsatz und legen Sie ihn in eine 35-mm-Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben einige Millimeter voneinander entfernt sind (so wird sichergestellt, dass jede Scheibe einzeln abgebildet werden kann).
- Geben Sie sofort eiskaltes "Wachstumsmedium" auf den Boden jeder Petrischale, unter den Gewebekultureinsatz, direkt unter dem oberen Rand des Gewebekultureinsatzes.
Anmerkung: Das Wachstumsmedium enthält mindestens 50 % essentielles Medium Eagle, 25 % Hanks' ausgewogene Salzlösung, 25 % Pferdeserum, 5 mg/ml D-Glukose, 2 mmol/l L-Glutamin, 1% antibiotisch-antimykotische Lösung und 10 mmol/l HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure), titriert auf pH 7,2 mit Natriumhydroxid.
- Wechseln Sie das Wachstumsmedium am Tag nach der Dissektion und danach alle 2 bis 3 Tage (verwenden Sie Wachstumsmedium bei 37 °C). Stellen Sie sicher, dass das Wachstumsmedium ausreichend hinzugefügt wird, aber nicht so sehr, dass es über die Membran des Gewebekultureinsatzes überläuft, was die Lebensfähigkeit der Gewebescheiben beeinträchtigen könnte.
- Vor der Verwendung in Experimenten sollten die Gewebescheiben in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid an der Luft 12 bis 14 Tage lang aufbewahrt werden.
>2. Vorbereitung der organotypischen Schnitte des Hippocampus für das experimentelle Blast-TBI-Protokoll
HINWEIS: Die Schritte dieses Abschnitts, mit Ausnahme der Bildgebung, finden in einer Laminar-Flow-Gewebekulturhaube statt.
- Setzen Sie die maßgefertigten Edelstahlringe in eine 6-Well-Platte ein (einer pro Well).
HINWEISE: Die Ringe haben einen Rand mit einer Kerbe (die in der 12-Uhr-Position sitzen sollte) und passen genau in die Vertiefungen, während die Gewebekultureinsätze leicht in diesen Rand passen. Achten Sie darauf, dass die Ringe mit einem bakteriziden Desinfektionsmittel gewaschen, gründlich mit gereinigtem Wasser abgespült, autoklaviert und vorher abkühlen gelassen werden.
- Füllen Sie die Vertiefung der 6-Well-Platte mit vorgewärmtem (37 °C) serumfreiem "Experimentiermedium" mit Propidiumiodid.
Anmerkung: Das Versuchsmedium mit Propidiumiodid besteht aus mindestens 75 % essentiellem Medium Eagle, 25 % hanks' ausgewogener Salzlösung, 5 mg/ml D-Glucose, 2 mmol/l L-Glutamin, 1 % antibiotisch-antimykotischer Lösung, 10 mmol/l HEPES und 4,5 μmol/l Propidiumiodid, titriert pH auf 7,2 mit Natriumhydroxid.
- Stellen Sie sicher, dass die mittlere Ebene nicht über die Kerbe des Rings hinausragt. Übertragen Sie die 6-Well-Platte mit den Ringen für 1 h zurück in den Inkubator, um sicherzustellen, dass das Medium unmittelbar vor dem Transfer der Gewebekultureinsätze 37 °C hat.
- Übertragen Sie die Gewebekultureinsätze mit den organotypischen Scheiben aus den 35 mm Petrischalen in die 6-Well-Platte mit den Ringen und das Versuchsmedium mit einer Pinzette.
- Mache mit einem Permanentmarker einen Punkt auf den Einlegerand in der 3-Uhr-Position.
Anmerkung: Die Einsätze werden während des Experiments von der 6-Well-Platte entfernt. Dieser Schritt erleichtert die Rückkehr des Einsatzes in seine ursprüngliche Position nach der Stoßwellenexposition und behält während des gesamten Protokolls den Überblick über jede Schnitte.
- Beschriften Sie jede 6-Well-Platte mit einem eindeutigen Namen und Datum und erstellen Sie eine Karte der Wells jeder Platte, indem Sie jede Well (z. B. A, B, C usw.) und jede Scheibe in jeder Vertiefung (z. B. 1, 2, 3 usw.) benennen, so dass jede Scheibe eine eindeutige Kennung hat (z. B. A1, A2, A3 usw.).
- Übertragen Sie die 6-Well-Platte unmittelbar vor der Bildgebung für 1 h in den Inkubator, um sicherzustellen, dass die Scheiben bei 37 °C sind.
Anmerkung: Vermeiden Sie überlaufendes Medium oder Luftblasen unter der Membran der Gewebekultureinlage, die die Lebensfähigkeit der Scheiben beeinträchtigen könnten.
- 1 h nach der Übertragung auf das Versuchsmedium wird jede Scheibe einzeln mit einem Fluoreszenzmikroskop (2X Objektiv, NA 0,06) abgebildet, das mit einem geeigneten Anregungs- (BP 535/50 nm) und Emissionsfilter (LP 610 nm) ausgestattet ist, um den Zustand der Scheibe zu beurteilen, bevor das Verletzungsprotokoll durchgeführt wird.
Notizen: Die Scheiben, die in diesem Stadium Bereiche mit dichter roter Färbung aufweisen, sollten als beeinträchtigt angesehen und von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden (diese machen in der Regel weniger als 10 % der Gesamtzahl der erzeugten Schichten aus). Stellen Sie sicher, dass die Bildgebung sequenziell und so schnell wie möglich durchgeführt wird, um die Zeit, in der sich die Scheiben außerhalb des Inkubators befinden, zu minimieren (in der Regel sollte die Abbildung von 6 Vertiefungen knapp 30 Minuten dauern).
- Lassen Sie den Deckel der 6-Well-Platte immer auf. Auf der Innenseite des Deckels kann sich etwas Kondenswasser bilden. Verwenden Sie in diesem Fall kurz einen Fön auf niedriger Stufe.
- Stellen Sie sicher, dass alle Bildgebungsbedingungen an verschiedenen Tagen und zwischen den Experimenten identisch sind.
Anmerkung: Ziel der Bildgebung ist es, die Fluoreszenz des Gewebes zu quantifizieren; Daher ist dieser Schritt wichtig, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten und einen Vergleich der Daten zu ermöglichen.
>3. Eintauchen und Transportieren der Gewebekultureinsätze mit den organotypischen Schnitten des Hippocampus
- Unmittelbar nach der Bildgebung wird in einer Laminar-Flow-Haube eine Gewebekultur mit einer Pinzette aus der 6-Well-Platte entnommen.
- Übertragen Sie den Einsatz vorsichtig in einen sterilen Polyethylenbeutel (3" x 5"), der mit 20 ml warmem (37 °C) experimentellem Medium gefüllt ist, das frisch mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid gefüllt ist.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass das mit Sauerstoff und Kohlendioxid angereicherte Versuchsmedium mindestens 40 Minuten lang mit einem Sinterglasbubbler in einer Dreschel-Flasche mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid gesprudelt und mit einer 20-ml-Spritze mit einem Bakterienfilter und einem sterilen Füllrohr (127 mm) in die sterilen Polyethylenbeutel in einer Laminar-Flow-Gewebekulturhaube überführt wurde. Verschließen Sie die Beutel sofort und stellen Sie sie für mindestens 1 h in einen 37 °C Inkubator, bevor Sie den Gewebekultureinsatz übertragen.
- Stellen Sie sicher, dass jeder sterile Beutel korrekt beschriftet ist (mit der Platte und der Well-Identifikation). Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden Gewebekultureinsatz. Schließen Sie die Luftblasen beim Verschließen der sterilen Beutel vorsichtig aus (sicher durch Drehen der Oberseite der Beutel und Anbringen einer Kunststoffklammer).
- Geben Sie die sterilen Beutel mit den Gewebekultureinsätzen und die 6-Well-Platten mit Experimentiermedium wieder in den 37 °C heißen Inkubator zurück.
- Verpacken Sie nach 1 Stunde die sterilen Beutel mit den Gewebekultureinsätzen vorsichtig in Kunststoffboxen in einer thermoregulierten Box, die mit entionisiertem Wasser bei 37 °C gefüllt ist, um die organotypischen Scheiben während des gesamten Stoßwellen-Expositionsprotokolls auf physiologischer Temperatur zu halten.
>4. Vorbereitung der Stoßwellenexposition des Stoßrohrs und des Hippocampus mit organotypischen Schichten
- Tragen Sie Stahlkappenschutzstiefel, einen Laborkittel und Handschuhe, während Sie das Stoßrohr vorbereiten und die Stoßwelle freilegen.
- Schrauben Sie den Rahmen des sterilen Beutelhalters mit dem distalen Flansch des Stoßdämpferrohrs an und stellen Sie sicher, dass das mittlere Loch mit dem Auslass des Stoßdämpferrohrs ausgerichtet ist (mit einem Blindstab).
- Montieren Sie zwei Druckaufnehmer radial: Sensor 1 im mittleren Teil des Abtriebsteils und Sensor 2 im distalen Flansch des Stoßdämpferrohrs (Abbildung 1A). Schließen Sie die Druckmessumformer über ein Netzteil an ein Oszilloskop an.
- Stellen Sie sicher, dass alle Ablassventile und Durchflussregler geschlossen sind.
- Öffnen Sie die externe Druckluftleitung und laden Sie das Magnetventil auf 2,5 bar.
- Öffnen Sie das Sicherheitsventil der Druckluftflasche und öffnen Sie langsam den Druckregler, um den Druck auf ca. 5 bar zu erhöhen.
HINWEIS: Der für diesen Regler eingestellte Druck sollte leicht über dem höchsten Membranberstdruck liegen.
- Bereiten Sie die Membranen vor, indem Sie 23 μm dicke Polyesterplatten in 10 x 10 cm2 große Quadrate schneiden. Bereiten Sie die Griffe mit Autoklavenband vor und kleben Sie sie an die Ober- und Unterseite jeder Membran.
- Eine Membran (einzelner Schlitz des Doppelverschlusses - Einzelmembrankonfiguration) oder zwei Membranen (beide Schlitze der Doppelverschluss- Doppelmembrankonfiguration) in der Verschluss positionieren (Abbildung 1B).
- Zentrieren Sie die Membranen und klemmen Sie sie mit vier Schrauben und Muttern M24, befestigen Sie sie nacheinander diagonalsymmetrisch und stellen Sie sicher, dass die Membranen faltenfrei sind.
- Klemmen Sie jeden sterilen Beutel einzeln in einer vertikalen Position auf den Halterrahmen und stellen Sie sicher, dass die Oberfläche der Gewebekultureinsätze mit den organotypischen Hippocampus-Schnitten zum Auslass des Stoßrohrs zeigt und der Gewebekultureinsatz im sterilen Beutel zentriert ist (Abbildung 1C). Stellen Sie sicher, dass der sterile Beutel rundum sicher festgeklemmt ist, um eine feste und gleichmäßige Immobilisierung zu gewährleisten.
- Tragen Sie einen Gehörschutz und eine Schutzbrille, wenn Sie Druck auf das Stoßdämpferrohr ausüben. Schalten Sie das Netzteil und das Oszilloskop ein, um die Stoßwellendaten zu erfassen (Erfassungsrate von 50 Megasamples/s, Rekordlänge 20 ms, 1 Million Punkte) und schließen Sie das Magnetventil.
- Betätigen Sie mit dem Durchflussregler auf dem Bedienfeld des Stoßdämpferrohrs langsam den Druck auf den Treiberlautstärkebereich des Stoßdämpferrohrs für die Einzelmembrankonfiguration oder sowohl den Treiberlautstärkebereich als auch den Doppelverschlussteil des Stoßdämpferrohrs für die Doppelmembrankonfiguration.
Anmerkung: Bei der Konfiguration mit einer Membran hängt der Berstdruck nur vom Membranmaterial und der Membrandicke ab, und die Membran reißt spontan, sobald der Berstdruck des Materials erreicht ist. Bei der Doppelmembrankonfiguration hängt der Berstdruck auch von der Gasdruckdifferenz sowohl in der Treiber- als auch in der Doppelverschlusskammer ab, und damit die Membranen kontrolliert platzen, wird das Doppelmembran-Sicherheitsventil manuell geöffnet, sobald der Zieldruck erreicht ist.
- Sobald die Membran reißt (ein lautes Geräusch erzeugt), schließen Sie schnell den Druckluftstrom mit dem Strömungsknopf und öffnen Sie das Magnetventil.
Anmerkung: Das Gesamtvolumen der Treibersektion kann durch das Einfügen von Ausblendsegmenten modifiziert werden, wodurch ein breiterer Bereich von Stoßwellenspitzenüberdruck und -dauern erreicht werden kann. Die ideale Kombination von Stoßwellenparametern sollte ausreichen, um eine Gewebeverletzung zu verursachen, aber nicht so hoch, dass sie zum Einsetzen der Gewebekultur oder zu einer Verformung oder einem Bruch des sterilen Beutels führt.
- Legen Sie jeden sterilen Beutel mit Gewebekultur frei, führen Sie ihn in eine einzelne Stoßrohrwelle ein und legen Sie ihn sofort wieder in die thermoregulierte Box zurück, bevor ein neuer steriler Beutel aus der Box entnommen und auf den Halterrahmen geklemmt wird. Stellen Sie sicher, dass die Schritte 4.10 bis 4.14 so reibungslos und schnell wie möglich (innerhalb weniger Minuten) ausgeführt werden, um ein Abkühlen des Versuchsmediums zu verhindern, da Temperaturen unter 37 °C die Verletzungsentwicklung beeinträchtigen können.
- Sobald alle Gewebekultureinsätze einer Stoßwelle (oder einem Scheinprotokoll) ausgesetzt wurden, legen Sie sie wieder in die ursprüngliche 6-Well-Platte und die entsprechende Vertiefung (in einer Laminar-Flow-Gewebekulturhaube) zurück und kehren Sie in den Inkubator zurück.
- Bewahren Sie die 6-Well-Platte bis zur weiteren Bildgebung mit 5 % Kohlendioxid an der Luft bei 37 °C im Inkubator auf.
- Fügen Sie Scheinkontrollen für jedes Experiment und die Stoßwellenexposition der Schicht hinzu.
Anmerkung: Scheinscheiben werden genauso behandelt wie die Scheiben, die einer Stoßwelle ausgesetzt sind (in den sterilen Beuteln mit Versuchsmedium versiegelt, in derselben thermoregulierten Box zum Stoßrohrlabor transportiert und für einen gleichwertigen Zeitraum am Metallrahmen aufgehängt), aber das Stoßrohr wird nicht gebrannt.
