Etablierung eines Alzheimer-Modells im Gehirn von Zebrafischen durch Amyloid-Peptid-Injektion

Zusammenfassung

Bhattarai, P., et al. Modellierung der Amyloid-β42-Toxizität und Neurodegeneration im Gehirn erwachsener Zebrafische. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion monomerer Amyloid-Peptide in das Vorderhirn von erwachsenen Zebrafischen, um Amyloid-Toxizität zu erzeugen, die die neuronalen Schäden nachahmt, die bei der Alzheimer-Krankheit beobachtet werden

Protokoll

>1. Herstellung des Aβ42-Peptids

1. Synthese von Peptiden (siehe Tabelle 1) unter Verwendung der Standardchemie von 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) mit 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronoiumhexafluorphosphat (HBTU) als Kupplungsreagenz auf einem automatisierten Festphasenpeptidsynthesizer. Der Maßstab der Synthese betrug 100 μmol.
2. Beladen Sie den automatisierten Peptidsynthesizer mit 500 mg des Fmoc-geschützten Harzes als feste Phase (Beladungskapazität von 0,2 mmol/g). Laden Sie die gelösten Fmoc-geschützten Aminosäuren in einer Konzentration von 0,5 M in das für den jeweiligen Synthesizer berechnete Volumen.
   Anmerkung: Die Berechnungen sind so angelegt, dass jede Fmoc-geschützte Aminosäure zweimal mit einem 5-fachen Überschuss jedes Bausteins an das Harz gekoppelt werden kann.
3. Löse die für die Peptidsynthese erforderlichen Reagenzien in Dimethylformamid (DMF) auf. Bereiten Sie z. B. den Aktivator HBTU in einer Konzentration von 0,48 M, 45 % v/v N-Methylmorpholin (NMM) (die Base) und 5 % v/v Essigsäureanhydrid (die Deckelmischung) vor, um die nicht umgesetzten Aminogruppen zu verschließen.
4. Trennen Sie alle Peptide vom Harz, indem Sie den festen Träger mit einem Rührwerk kontinuierlich in einem frisch zubereiteten Spaltgemisch bestehend aus Trifluoressigsäure (TFA): Triisopropylsilan (TIS): Wasser: Dithiothreitol (DTT) bei 90 (v/v): 5 (v/v): 2,5 (v/v): 2,5 (m/v) für 4 h mischen. Verwenden Sie 10 mL für den Synthesemaßstab von 100 μmol.
5. Das gespaltene Produkt wird ausgefällt, indem die Spaltmischung zu 100 mL eiskaltem Diethylether gegeben wird. Passieren Sie eine Filtrationseinheit mit einem Polytetrafluorethylen (PTFE)-Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm und waschen Sie mit 20 mL eiskaltem Diethylether.
6. Sammeln Sie das gefilterte Peptid vom Filterpapier und lösen Sie 100 mg gefälltes Peptid in 5 mL destilliertem deionisiertem Wasser auf: Acetonitril im Verhältnis 1:1.
7. Aufreinigung mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf einer semipräparativen HPLC, die mit einer porösen Polystyrol-Divinylbenzolsäule mit einer Beadgröße von 10 μm ausgestattet ist.
   1. Heizen Sie die Säule vor und halten Sie sie mit einer Säulenheizung auf 50 °C. Sammeln Sie alle wichtigen Fraktionen mit einem automatisierten Fraktionssammler, indem Sie über 25 Minuten bei 4 mL/min einen Gradienten von 5 % auf 100 % Lösungsmittel B anwenden.
      Anmerkung: Lösungsmittel A ist 0,1 % TFA in Wasser und Lösungsmittel B ist 0,1 % TFA in Acetonitril.
   2. Überwachen Sie das Chromatogramm bei 220 nm, sammeln Sie die entsprechenden Peaks und analysieren Sie es mit der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS).
8. Bestätigung der Reinheit durch analytische Umkehrphasen-Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatographie (UPLC) bei 220 nm und Überwachung mit einem Ultraviolett (UV)-Detektor, während die Probe durch eine analytische C18-Säule (Kügelchengröße 1,7 μm) geleitet wird. Bestätigen Sie das Peptidprodukt durch Massenspektrometrie.
   Anmerkung: Der UPLC ist mit einer Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie (ESI-MS) und einem Tandem-Quadrupol-Detektor gekoppelt.
9. Die richtigen Fraktionen des gewünschten Peptids werden in einem Rundkolben lyophilisiert, indem ein Vakuum von 0,052 mbar auf ein flauschiges Pulver aufgebracht wird. Koppeln Sie die Vakuumpumpe an eine Gefriereinheit, die bei -78 °C gehalten wird. Lagern Sie sie unbegrenzt bei -80 °C.
10. Verwenden Sie das lyophilisierte Peptid, um eine Stammlösung von 1 mM in einer Mischung aus Acetonitril, DMF und Wasser in analytischer Qualität im Verhältnis 1:1:1 für die Experimente herzustellen. Diese Lösung kann mindestens 6 Monate gelagert werden, da sich die Peptide darin nicht ansammeln.

2. Zubereitung der Injektionsmischung

1. Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) für die Verdünnung der lyophilisierten Peptide vor.
2. Löse das Peptid auf eine Endkonzentration von 20 μM in PBS auf. Bereiten Sie diese Lösung frisch zu. Gut mischen und bis zur Injektion auf Eis lagern. Überschreiten Sie nicht 30 Minuten, um eine Aggregation in der Lösung zu vermeiden.

>3. Anästhesie

1. Bereiten Sie die Stammlösung des Anästhetikums, 0,1 % Ethyl-m-aminobenzoat-Methansulfonat (MESAB), in normalem Fischwasser aus dem Kreislaufsystem vor. Bereiten Sie die Anästhesielösung auf eine Endkonzentration von 0,0025 % (v/v) vor.
2. Entnehmen Sie die gewünschte Anzahl Fische aus dem Aquarium in einen Transportbehälter mit 5 l Systemwasser.
3. Füllen Sie eine Petrischale aus Kunststoff (90 mm) zur Hälfte mit 40 ml Anästhetika. Verwenden Sie diese Schale für Injektionszwecke.
4. Inkubieren Sie den Fisch in den Narkosemitteln, bis die Operationsbewegung aufgehört hat.

>4. Zerebroventrikuläre Mikroinjektion

1. Vorbereitung der Injektionsapparatur
   1. Bereiten Sie die Glasinjektionskapillaren mit einem Nadelabzieher mit folgenden Parametern vor: Heizzyklus 537, Zugzyklus 250, Geschwindigkeit 1,5 s, Zeit 80 ms.
   2. Bringen Sie die Druckeinstellung an der Druckquelle auf 25 psi.
   3. Stellen Sie die Parameter des Mikroinjektors auf 20 psi für Hold und 10 psi für Auswurf, 2,5 psi für Periode und 100 ms für Gating ein.
   4. Laden Sie die Glaskapillare mit der Injektionslösung. Führen Sie die Glaskapillare in den Mikroinjektionshalter ein. Stellen Sie den Einspritzwinkel auf 45° ein.
2. Legen Sie einen Fisch in eine neue Petrischale, die mit Betäubungslösung gefüllt ist.
3. Halten Sie den Fisch mit der Pinzette fest und richten Sie ihn für die Injektion aus.
4. Erzeugen Sie einen Schlitz mit der Spitze einer 30-G-Nadel im Schädel über dem optischen Tectum, wo sich die beiden lateralen Platten treffen. Führen Sie die Spitze nicht in das Hirngewebe ein, da dies zu Blutungen und Schäden führen würde.
5. Führen Sie die Glaskapillare in den Schlitz ein.
   1. Verwenden Sie nur die Spitze der Nadel und dringen Sie nicht mehr als 1 mm durch den Schädel ein. Halten Sie den Fisch weiter fest und führen Sie die Spitze der Glaskapillare durch die Einschnittstelle ein.
   2. Richten Sie die Spitze der Glaskapillare in einem Winkel von 45° in Richtung Telencephalon aus. Injizieren Sie 1 μl der Lösung. Die Flüssigkeit dispergiert sich unmittelbar nach der Injektion.

>5. Wiederherstellung

1. Setzen Sie den Fisch wieder in einen Transportbehälter, bis er sich erholt hat. Verbinden Sie den Behälter mit dem regelmäßig zirkulierenden Fischwasser, um eine optimale Wasserqualität zu gewährleisten.
   Anmerkung: Die Wiederherstellung sollte normalerweise 1 Minute dauern. Dauert es länger, muss der Fisch kürzer in der Narkose gehalten werden (der Experimentator muss dies optimieren).

Ergebnisse

Tabelle 1: Aβ42- und TR-Aβ42-Peptidsequenzen.

Peptid	Peptid-Sequenz	MW (g/mol)
Aβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	Nr. 4514.1
TR-Aβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fmoc-geschützte Aminosäuren	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Deutschland)		Fmoc-basierte Aminosäuren für die Festphasenpeptidsynthese (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uroniumhexafluorphosphat (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Deutschland)	RL-1030	Aktivator
Oxym	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Deutschland)	RL-1180	Racemisierungs-Unterdrücker
N,N-Diisopropylethylamin	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Deutschland)	SOL-003	Basis
Dimethylformamid	IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Deutschland)	SOL-004	Lösungsmittel
N-Methylmorpholin	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Deutschland	Nr. A12158	Basis
1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)	157260 ALDRICH	Aktivator
Piperidin	MERCK KGaA (Darmstadt, Deutschland)	822299	Fmoc Reagenz zur Entschützung
Dichlormethan (DCM)	MERCK KGaA (Darmstadt, Deutschland)	Artikel-Nr.: 106050	Lösungsmittel
Ameisensäure (FA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Deutschland)	100264	Pufferkomponente für die HPLC
Trifluoressigsäure (TFA)	MERCK KGaA (Darmstadt, Deutschland)	Artikel-Nr.: 808260	Clevage Mixture Reagenz
Triisopropylsilan (TIS)	MERCK KGaA (Darmstadt, Deutschland)	233781 ALDRICH	Clevage Mixture Reagenz
Acetonitril (für UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1L	Lösungsmittel
Acetonitril (für HPLC)	VWR International Ltd, England	Artikel-Nr.: 83639.32	Lösungsmittel
Diethylether	VWR International Ltd, England	Artikel-Nr.: 23811.326	Lösungsmittel für die Peptidfällung
Dithiotritol (DVB-T)	VWR International Ltd, England	0281-25G	Clevage Mixture Reagenz
TentaGel S RAM Fmoc Eisbahn-Amidharz	Rapp Polymere GmbH (Tübingen, Deutschland)	Nr. S30023	Festphase für SPPS
Peptidsynthese 5 ml Spritzen mit mitgelieferten Filtern	Intavis AG (Köln, Deutschland)	34.274	Reaktionsgefäß für SPPS und für Clevage aus der Festphase
Filter aus Polytetrafluorethylen (PTFE)	Sartorius Stedtim (Aubagne, Frankreich)	11806-50-N	Filtration von gefällten Peptiden
Spritzenvorsatzfilter aus Polyvinylidenfluorid (PVDF)	Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe	KC78.1	Vorfiltration für die HPLC
Peptid-Synthesizer	Intavis, Köln, Deutschland	ResPep SL	Automatisierter Festphasen-Peptidsynthesizer
Wasser-Allianz HPLC	Waters, Milford, Massachusetts, Vereinigte Staaten von Amerika	Gewässer 2998, Gewässer e2695	Semi-präparative Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)
PolymerX, Raupengröße 10μm, 250x10 mm	Phenomenex Ltd. Deutschland	00G-4328-N0	Poröse Polystyrol-Divinylbenzol-HPLC-Säule
Milli-Q Advantage A10, mit einem Milli-Q Filter	EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA	LCPAK0001	Wasseraufbereitungssystem
Filtrationseinheit	Sartorius Stedtim (Aubagne, Frankreich)	Artikel-Nr.: 16307	Filtrationseinheit für die Peptidfällung
UPLC Aquity mit UV-Detektor	Waters, Milford, Massachusetts, Vereinigte Staaten von Amerika	M09UPA 664M	Analytische Umkehrphasen-Ultra-HPLC für LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, Raupengröße 1,7 μm, 50x2,1 mm	Waters, Milford, Massachusetts, Vereinigte Staaten von Amerika	186002350	Analytische C18-Säule
ACQUITY TQ Detektor	Waters, Milford, Massachusetts, Vereinigte Staaten von Amerika	QBB908	Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + Vakuummarke RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Deutschland	16706, 101542	Gefriertrockner mit Vakuumpumpe
Paradigmen-Plattenleser	Beckman Coulter
MESAB (Ethyl-m-aminobenzoat-Methansulfonat)	Sigma-Aldrich	Nr. A5040
Petrischalen	Sarstedt	821.472
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Life Technologies, GIBCO	Tel.: 10010-056
Nadel	Becton-Dickinson	305178
Präpariermikroskop	Olympus, Leica, Zeiss	Variiert je nach Hersteller
Dumont Pinzette	Welt Präzisionsinstrumente	501985
Gillies Präparierzange	Welt Präzisionsinstrumente	501265
Injektionskapillaren aus Glas	Welt Präzisionsinstrumente	TWF10
PicoDüse	Welt Präzisionsinstrumente	5430-12
Pneumatische PicoPump	Welt Präzisionsinstrumente	SYS-PV820
Ringbeleuchtung; Ringlicht-Leitfaden	Parkland Scientific	ILL-RLG

kg kg kg